標(biāo)簽：細(xì)胞系  原代培養(yǎng)   動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)   細(xì)胞培養(yǎng) 

ATCC 細(xì)胞系和雜交瘤在干冰上冷凍在冷凍保存小瓶中運(yùn)輸，或在環(huán)境溫度下作為培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)生長物的運(yùn)輸。收到冷凍細(xì)胞后，重要的是要立即通過解凍和去除 DMSO 并將它們放入培養(yǎng)物中來恢復(fù)它們。如果這是不可能的，請(qǐng)將細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮蒸氣中（低于 -130°C ）。不要將冷凍細(xì)胞儲(chǔ)存在 -130°C 以上的溫度，因?yàn)樗鼈兊幕盍?huì)迅速下降。

培養(yǎng)基的制備

通過組裝適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、血清和生長所需的其他試劑，為恢復(fù)細(xì)胞系做好準(zhǔn)備。這些產(chǎn)品中有許多可從 ATCC 獲得，并且可以與細(xì)胞系一起訂購。這些試劑與 ATCC 用于細(xì)胞生長和保存的試劑相同。 雖然大多數(shù)細(xì)胞系可以在一種以上的培養(yǎng)基中復(fù)制，但當(dāng)培養(yǎng)基改變時(shí)，它們的特性可能會(huì)改變。因此，建議在 ATCC 使用的相同培養(yǎng)基中開始細(xì)胞培養(yǎng)以獲得最佳結(jié)果（參見產(chǎn)品信息表和 ATCC 網(wǎng)站）。

ATCC 細(xì)胞系的培養(yǎng)

1.準(zhǔn)備一個(gè)培養(yǎng)容器，使其包含產(chǎn)品表中列出的推薦體積的適當(dāng)培養(yǎng)基，并針對(duì)溫度和 pH 值 (CO 2 ) 進(jìn)行平衡。

2.在 37°C 或該細(xì)胞系的正常生長溫度的水浴中輕輕攪拌，解凍小瓶。解凍應(yīng)該很快，大約 2 分鐘或直到冰晶融化。

3.從水浴中取出小瓶并通過浸入或噴灑 70% 乙醇來凈化它。在層流組織培養(yǎng)罩中遵循嚴(yán)格的無菌條件進(jìn)行所有進(jìn)一步操作。

4.擰開小瓶的頂部，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到含有 9 mL 推薦培養(yǎng)基的無菌離心管中。通過溫和離心（125 × g 下 10 分鐘）除去冷凍保護(hù)劑 (DMSO)。

5.丟棄上清液，將細(xì)胞重新懸浮在 1 或 2 毫升的完全生長培養(yǎng)基中。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到含有完全生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中，輕輕搖動(dòng)徹底混合。

6.在24 小時(shí)后檢查細(xì)胞培養(yǎng)物，并根據(jù)需要進(jìn)行繼代培養(yǎng)。這里需要注意的是一些細(xì)胞系，例如雜交瘤，需要幾天時(shí)間才能從冷凍保存中完全恢復(fù)。一些雜交瘤在培養(yǎng)的第一天存活率很低，會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞碎片。在此之后，細(xì)胞培養(yǎng)將開始恢復(fù)并進(jìn)入指數(shù)增長。

處理搖瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)物

一些 ATCC 細(xì)胞作為培養(yǎng)容器中的生長培養(yǎng)物運(yùn)輸。這些容器中接種細(xì)胞，培養(yǎng)以確保細(xì)胞生長，然后完全填充培養(yǎng)基以進(jìn)行運(yùn)輸。

收到搖瓶培養(yǎng)物后，目視檢查培養(yǎng)基是否有微生物污染的宏觀證據(jù)。這包括不尋常的 pH 值變化（酚紅呈黃色或紫色）、濁度或顆粒。使用低倍（100 倍）倒置顯微鏡檢查培養(yǎng)基中是否有微生物污染的證據(jù)以及細(xì)胞的形態(tài)。

如果細(xì)胞附著并以單層生長：

需要以無菌方式去除除 5 mL 至 10 mL 外的所有運(yùn)輸介質(zhì)。運(yùn)輸介質(zhì)可以保存以備重復(fù)使用，并應(yīng)儲(chǔ)存在 4°C。

在產(chǎn)品說明書中推薦的溫度和 CO 2濃度下（37°C，大多數(shù)細(xì)胞系為5% CO 2 ）孵育培養(yǎng)瓶，直到細(xì)胞傳代。

如果細(xì)胞未附著或懸浮生長：

將搖瓶中的全部?jī)?nèi)容物無菌轉(zhuǎn)移到離心管中。

以 125 × g 離心 5 到 10 分鐘。

除去 10 mL 的運(yùn)輸介質(zhì)上清液，然后重新懸浮細(xì)胞。將此培養(yǎng)基的剩余部分儲(chǔ)存在 4°C 以備后用。

根據(jù)細(xì)胞系，將重懸的細(xì)胞無菌轉(zhuǎn)移到 25-cm 2燒瓶或 75-cm 2燒瓶中（參見產(chǎn)品表）。

在產(chǎn)品信息表中推薦的溫度和 CO 2濃度下孵育細(xì)胞，直到細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

原代細(xì)胞的特點(diǎn)

由于大多數(shù)細(xì)胞系都是從一塊切碎或酶分散的組織開始的原代培養(yǎng)物。原代培養(yǎng)物是幾種細(xì)胞類型的混合物，保留了其源組織的特征。

一段時(shí)間后，原代培養(yǎng)物將達(dá)到匯合，即由于細(xì)胞膨脹而覆蓋培養(yǎng)容器的所有可用空間的狀態(tài)。此時(shí)，需要將培養(yǎng)物分解（通常使用胰蛋白酶等蛋白水解酶）分解為單個(gè)細(xì)胞并進(jìn)行繼代培養(yǎng)（分裂、傳代或轉(zhuǎn)移）。在第一次傳代之后，培養(yǎng)物通常被稱為細(xì)胞系。隨著隨后的每次傳代，細(xì)胞群變得更加均勻，因?yàn)樯L速度更快的細(xì)胞占主導(dǎo)地位。也可以通過克隆從培養(yǎng)物中選出具有所需特性的細(xì)胞。

二倍體細(xì)胞系很少會(huì)超過幾個(gè)種群倍增。它們的復(fù)制能力有限，在 20 到 80 次種群倍增后開始減慢并最終停止分裂。

1. 有證據(jù)表明，在細(xì)胞培養(yǎng)中觀察到的一些細(xì)胞衰老可能是由于不適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，而不是預(yù)先確定的復(fù)制衰老。

2. 還有一些數(shù)據(jù)支持某些物種（尤其是人類）細(xì)胞的復(fù)制性衰老，即使在改進(jìn)的培養(yǎng)條件下生長也是如此。這種衰老是通過每次細(xì)胞分裂時(shí)染色體末端（端粒）的縮短來介導(dǎo)的。

3. 相比之下，連續(xù)（或永生化）細(xì)胞系具有無限的復(fù)制能力。這些細(xì)胞系通過永生化或通過多種方法中的任何一種進(jìn)行轉(zhuǎn)化而衍生自細(xì)胞系。許多連續(xù)細(xì)胞系來源于腫瘤組織。ATCC 集合中的大多數(shù)細(xì)胞系是連續(xù)的，但少數(shù)細(xì)胞系，例如 CCD-1117Sk 人類皮膚成纖維細(xì)胞 ( ATCC CRL-2465 ) 或 CCD-18Co 人類結(jié)腸 ( ATCC CRL-1459 ) 是有限的。

如培養(yǎng)容器部分所述，細(xì)胞系可以附著在表面（依賴錨固）或懸?。ú灰蕾囧^固）生長。當(dāng)細(xì)胞在單層或懸浮液中生長和分裂時(shí)，它們通常遵循由四個(gè)階段組成的特征性生長模式：滯后、對(duì)數(shù)或指數(shù)、靜止或平穩(wěn)期和衰退期 。

滯后期 — 接種培養(yǎng)容器后，細(xì)胞立即緩慢生長，同時(shí)從傳代培養(yǎng)的壓力中恢復(fù)。

對(duì)數(shù)期或指數(shù)期 — 細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增長期，持續(xù)到整個(gè)生長表面被占據(jù)或細(xì)胞濃度超過培養(yǎng)基容量。

靜止期 — 細(xì)胞增殖減慢并停止。

衰退期——如果不更換培養(yǎng)基且細(xì)胞數(shù)量不減少，細(xì)胞將失去活力，數(shù)量減少。

為了確?；盍?、遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定性，細(xì)胞系需要保持在指數(shù)期。這意味著它們需要在進(jìn)入穩(wěn)定生長期、單層細(xì)胞 100% 匯合之前或懸浮液達(dá)到其推薦的最大細(xì)胞密度之前定期傳代培養(yǎng)。為每個(gè)細(xì)胞系生成生長曲線有助于確定細(xì)胞系的生長特性。

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