近 80% 的CAR-T抗體由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CHO) 細(xì)胞產(chǎn)生。為了實(shí)現(xiàn)更好的細(xì)胞生長(zhǎng)和高產(chǎn)重組蛋白，補(bǔ)料分批培養(yǎng)通常用于在 CHO 細(xì)胞中生產(chǎn)重組蛋白。根據(jù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗的需要，在細(xì)胞培養(yǎng)中加入含有多種成分的補(bǔ)料培養(yǎng)基，可以影響細(xì)胞生長(zhǎng)特性，提高重組蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量。補(bǔ)料分批優(yōu)化應(yīng)與 細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境參數(shù)、培養(yǎng)基 組成、補(bǔ)料策略等綜合因素相 關(guān)聯(lián)。

在重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CHO) 細(xì)胞作為 RTP 生產(chǎn)的常用細(xì)胞主要以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：

①不易被人類病毒感染，安全性高；

② 具有類似于人類細(xì)胞的翻譯后修飾的RTPs；

③ 高密度 CHO 細(xì)胞可以使用化學(xué)成分確定的無(wú)血清培養(yǎng)基 (CD-SFM) 進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并產(chǎn)生分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)。

如今，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的 mAb 生產(chǎn)主要通過(guò)大型生物反應(yīng)器中的補(bǔ)料分批工藝進(jìn)行。CHO 細(xì)胞通常以分批補(bǔ)料模式培養(yǎng)，以實(shí)現(xiàn)較大細(xì)胞密度和產(chǎn)物滴度，連續(xù)或推注補(bǔ)料添加。初始細(xì)胞生長(zhǎng)由基礎(chǔ)培養(yǎng)基支持。在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中添加濃縮補(bǔ)料培養(yǎng)基以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)并延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。補(bǔ)料培養(yǎng)基可以避免營(yíng)養(yǎng)限制，并可以促進(jìn)重組蛋白的更高產(chǎn)量。補(bǔ)料分批處理后靜止期細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間比分批培養(yǎng)長(zhǎng)。補(bǔ)料分批培養(yǎng)需要了解細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞代謝的特征，以及影響 RTP 質(zhì)量和產(chǎn)量的關(guān)鍵工藝參數(shù)。CHO 細(xì)胞在指數(shù)期高速生長(zhǎng)，葡萄糖和氨基酸的消耗加速，導(dǎo)致乳酸和銨的積累需要使用葡萄糖乳酸分析儀對(duì)乳酸變化進(jìn)行分析。在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，溫度、pH 和其他工藝參數(shù)也會(huì)對(duì)抗體表達(dá)和質(zhì)量屬性產(chǎn)生影響。

CHO細(xì)胞培養(yǎng)

貼壁 CHO 細(xì)胞在含有 10% 胎牛血清 (FBS) 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基中于 37℃、5% CO 2條件下生長(zhǎng)。選擇 SFM 進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，支持從貼壁培養(yǎng)到懸浮培養(yǎng)模式的轉(zhuǎn)變。基礎(chǔ)培養(yǎng)基用于貼壁培養(yǎng)，包括來(lái)自胎牛的血清成分。血清成分復(fù)雜，容易受到污染。SFM分為普通無(wú)血清培養(yǎng)基、無(wú)異源培養(yǎng)基、無(wú)動(dòng)物培養(yǎng)基、無(wú)蛋白培養(yǎng)基和化學(xué)成分確定的無(wú)血清培養(yǎng)基; . 在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方面，SFM可以有效避免血清培養(yǎng)帶來(lái)的污染、純化困難等缺點(diǎn)。

  分批培養(yǎng)是指加入一次SFM后，一次性收獲重組蛋白的培養(yǎng)方法。由于樣品采集時(shí)培養(yǎng)時(shí)間短和細(xì)胞密度不理想，RTP 生產(chǎn)不理想。補(bǔ)料分批模式提高了 RTP 生產(chǎn)。據(jù)報(bào)道，補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的 mAb 滴度已達(dá)到 10 g/L 以上。近年來(lái)，流加工藝已成為大規(guī)模生產(chǎn)RTPs的重要生產(chǎn)工藝。然而，保持細(xì)胞的高生產(chǎn)力和蛋白質(zhì)的質(zhì)量屬性仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。因此，流加培養(yǎng)已經(jīng)從單純的高產(chǎn)重組蛋白轉(zhuǎn)向了高產(chǎn)和高質(zhì)量生產(chǎn)的雙重目標(biāo).

補(bǔ)料分批培養(yǎng)環(huán)境參數(shù)

培養(yǎng)環(huán)境的參數(shù)會(huì)直接影響 CHO 細(xì)胞生長(zhǎng)、重組蛋白表達(dá)、以及蛋白糖基化、細(xì)胞代謝物等 。細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)瓶或搖瓶進(jìn)行擴(kuò)增，然后在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。一臺(tái)生物反應(yīng)器主要參考的培養(yǎng)環(huán)境參數(shù)有溫度、溶解氧 (DO值) 、pH值 和代謝產(chǎn)物積累等方面。

1.溫度對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

實(shí)踐證明，低溫對(duì)完整細(xì)胞密度、細(xì)胞活力和細(xì)胞比生產(chǎn)力具有積極影響。培養(yǎng)降溫一般在指數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行。為了減少細(xì)胞凋亡和促進(jìn)抗體合成，將培養(yǎng)溫度從 37 ℃ 切換到 29 ℃ 至 35 ℃ 的較低溫度。

2.滲透壓對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

在補(bǔ)料分批培養(yǎng)的培養(yǎng)后期，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝副產(chǎn)物積累都能夠增加細(xì)胞外滲透壓。在補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程中，可以適當(dāng)通過(guò)NaCl,CaCl2,MgCl2等物質(zhì)來(lái)逐漸適當(dāng)?shù)卦黾訚B透壓,以增加 mAb 的滴度，減少半乳糖基化，并適當(dāng)增加高甘露糖糖基化的比例，提高生產(chǎn)效率。

3.酸堿度

  正常情況下CHO 細(xì)胞適宜的 pH值 范圍為 7.2 ~ 7.6之間。所以，優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)物的 pH 值才能生產(chǎn)除高質(zhì)量的重組蛋白。比如在將表達(dá)VEGF-MA 的CHO細(xì)胞放在在3L生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)時(shí)，使用碳酸氫鈉進(jìn)行pH值的調(diào)整。當(dāng)pH值設(shè)為7.10時(shí)，VEGF-MA的產(chǎn)量甚至達(dá)到4.1 g/L ，而電荷異質(zhì)性、糖基化水平、蛋白質(zhì)純度分別可以達(dá)到26.1%、59.1%和95.1%. 如果細(xì)胞培養(yǎng)物的 pH 值保持在 6.8 以下或 7.6 以上，CHO 細(xì)胞的生長(zhǎng)就會(huì)受到負(fù)面影響。所以通過(guò)控制適宜的PH生長(zhǎng)環(huán)境可以起到促進(jìn)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，從而實(shí)現(xiàn)重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)。

4.解氧

DO 是大規(guī)模過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)境參數(shù)之一，它影響細(xì)胞生長(zhǎng)和重組蛋白生產(chǎn)。CHO 細(xì)胞中的大多數(shù) DO 值通常在 20% 到 50% 的范圍內(nèi)。據(jù)報(bào)道，在補(bǔ)料分批培養(yǎng)模式下，當(dāng) DO 值為 20% 時(shí)，重組促甲狀腺激素 (rTSH) 的滴度為 1.6 mg/L  當(dāng) DO 值調(diào)整為 40%，表達(dá)人 IgG1 mAb 的 CHO 細(xì)胞在提供有乙酸銅和檸檬酸鐵的補(bǔ)料分批培養(yǎng)物中培養(yǎng)，mAb 的產(chǎn)量在 14 天的補(bǔ)料分批培養(yǎng)中可以達(dá)到 10 g/L 以上，從這里可以看出，乙酸銅和檸檬酸鐵在減少了 man5 含量和 mAb 的酸性電荷變體的同時(shí)也增加了 G1F 的比例。 

補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的代謝副產(chǎn)物

在細(xì)胞培養(yǎng)的后期，補(bǔ)料分批培養(yǎng)通常會(huì)儲(chǔ)存乳酸和銨鹽等副產(chǎn)物。高濃度的代謝副產(chǎn)物不利于細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體表達(dá)。CHO細(xì)胞中葡萄糖通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，通過(guò)糖酵解產(chǎn)生大量丙酮酸。部分丙酮酸使用乳酸脫氫酶進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乳酸. 為了培養(yǎng)表達(dá) Fc 融合蛋白的 CHO 細(xì)胞并減少補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的乳酸積累，使用半乳糖作為碳源以減少乳酸積累。表達(dá)抗 HIV 抗體 VRC01 的 CHO-K1 細(xì)胞在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中培養(yǎng)。從第 3 天開始每天添加補(bǔ)料培養(yǎng)基。在細(xì)胞接種 12 小時(shí)后，將 10 mM 和 30 mM NH 4 Cl 添加到 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)基中。使用EKF葡萄糖乳酸測(cè)定儀進(jìn)行葡萄糖乳酸分析與對(duì)照組相比，30 mM NH 4 Cl處理組VCD和培養(yǎng)時(shí)間明顯減少，乳酸、葡萄糖、銨和谷氨酰胺等副產(chǎn)物積累。特別是，銨對(duì)抗體滴度和細(xì)胞特異性生產(chǎn)力有負(fù)面影響.

   另外，研究發(fā)現(xiàn)，向 CHO 細(xì)胞中添加包括α-酮戊二酸 (α-KG)、蘋果酸和琥珀酸在內(nèi)的 TCA 循環(huán)中間體可以減少補(bǔ)料分批培養(yǎng)中乳酸和銨的積累，并提高細(xì)胞特異性生產(chǎn)力和抗體滴度。在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中設(shè)計(jì)連續(xù)補(bǔ)料策略。他們發(fā)現(xiàn)，由于 7 升生物反應(yīng)器中有大量營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)料培養(yǎng)基，連續(xù)補(bǔ)料減少了乳酸和銨的積累。從而促進(jìn)了C12抗體的產(chǎn)生。在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，應(yīng)避免副產(chǎn)物。建議分批補(bǔ)料培養(yǎng)選擇可用的補(bǔ)料策略，以降低代謝副產(chǎn)物積累的可能性和濃度。

恒化培養(yǎng)

  為了提高 RTP 的細(xì)胞特異性生產(chǎn)力，成功的策略需要控制培養(yǎng)基中的培養(yǎng)溫度和葡萄糖濃度。不幸的是，細(xì)胞培養(yǎng)的變化會(huì)影響特定的增長(zhǎng)率，尤其是在兩個(gè)操作變量中。為了在 CHO 細(xì)胞中生產(chǎn)重組人組織纖溶酶原激活劑，研究者利用恒化器培養(yǎng)并設(shè)置三組關(guān)于喂養(yǎng)介質(zhì)的 20 mM、30 mM 和 40 mM 葡萄糖濃度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) 40 mM 葡萄糖濃度組限制了細(xì)胞生長(zhǎng)，但它增加了 rh-tPA 和 G2/M 期細(xì)胞的細(xì)胞特異性生產(chǎn)力。此外，當(dāng)溫度條件為 33°C 時(shí)，使用EKF葡萄糖乳酸分析儀測(cè)定發(fā)現(xiàn)葡萄糖消耗和乳酸生成率降低。

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