通過下一代測(cè)序 (NGS) 來驗(yàn)證，能夠在核苷酸水平分辨率下進(jìn)行大規(guī)模評(píng)估基因編輯的準(zhǔn)確性和可靠性。高效、可自動(dòng)化和可擴(kuò)展的 CIRCLE-seq 是一種體外 NGS 測(cè)定，可以對(duì) CRISPR 介導(dǎo)的切割進(jìn)行靈敏的脫靶檢測(cè)。

CRISPR-Cas9 基因編輯

CRISPR 代表成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列。這些重復(fù)的 DNA 片段最初來源于病毒病原體，并作為模板將 CRISPR 相關(guān)蛋白 9 (Cas9) 核酸內(nèi)切酶引導(dǎo)至新入侵的病毒。當(dāng) Cas9 遇到同源病毒序列時(shí)，它會(huì)產(chǎn)生近端雙鏈斷裂 (DSB)。類似地，當(dāng) Cas9 和指導(dǎo) RNA (gRNA) 被轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，接近 gRNA 的同源序列被切割。然后通過內(nèi)源性易出錯(cuò)的非同源末端連接 (NHEJ) 過程將末端重新連接在一起，或使用外源提供的供體（修復(fù)）模板通過同源定向修復(fù) (HDR) 進(jìn)行修補(bǔ)，從而修復(fù) DSB。

研究人員使用 HDR 以已知且可預(yù)測(cè)的方式改變基因序列。gRNA 決定編輯將在何處進(jìn)行，而供體模板 DNA（其末端與 DSB 站點(diǎn)共享同源性）決定編輯的外觀。

由于這些是關(guān)鍵組件，因此確保 gRNA 和修復(fù)模板沒有錯(cuò)誤非常重要。使用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶等優(yōu)質(zhì)試劑進(jìn)行擴(kuò)增有助于確保準(zhǔn)確性和特異性。

NGS 驗(yàn)證法

   即使使用的聚合酶為 CRISPR HDR 生成準(zhǔn)確的修復(fù)模板，實(shí)驗(yàn)室也需要一種方法來驗(yàn)證基因編輯是否成功——編輯的位點(diǎn)包含預(yù)期的序列。NGS 提供了一種高通量、自動(dòng)化友好的方法來驗(yàn)證克隆分離物中的目標(biāo)基因編輯。

   為了從 NGS 中獲得最佳結(jié)果，強(qiáng)大的文庫(kù)制備必不可少。Dana-Farber 癌癥研究所的分子生物學(xué)核心設(shè)施 (MBCF) 發(fā)現(xiàn) KAPA HyperPrep 試劑盒提供的工作流程能夠適應(yīng)各種擴(kuò)增子輸入量和大小，從而最大限度地減少輸入 QC 和特定樣本工作流程修改的需要. 使工作流程適應(yīng)他們的自動(dòng)液體處理系統(tǒng)，允許在大約 3-1/2 小時(shí)的儀器時(shí)間內(nèi)基于擴(kuò)增子的文庫(kù)制備 96 個(gè)克隆樣本。

CRISPR的切割位點(diǎn)的優(yōu)化

   驗(yàn)證預(yù)期的位點(diǎn)是否已成功修改是一回事，但無論計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)多么徹底，基于 CRISPR/Cas9 的基因編輯中使用的 Cas9 核酸酶都有可能以類似的方式切割和改變非預(yù)期的目標(biāo)序列。因此，實(shí)驗(yàn)室需要一種方法來識(shí)別可能的脫靶切割位點(diǎn)，并能夠?qū)⑦@些位點(diǎn)與擴(kuò)增導(dǎo)致的簡(jiǎn)單錯(cuò)誤區(qū)分開來。有幾種 NGS 工作流程可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。

    例如，Digenome-seq 是一種相對(duì)簡(jiǎn)單的體外檢測(cè)方法，其中使用 Cas9 核酸酶切割從目標(biāo)細(xì)胞中提取的基因組 DNA，將 NGS 測(cè)序接頭連接到所有游離端，并對(duì)生成的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序以鑒定削減。然而，由于文庫(kù)沒有針對(duì)切割位點(diǎn)進(jìn)行富集，因此未修飾 DNA 的背景很高，需要大量的測(cè)序讀數(shù)，并且很難找到罕見的切割事件。

GUIDE-seq 方法

   通過先在體內(nèi)富集摻入 Cas9 引入的 DSB 中的寡核苷酸來降低測(cè)序成本。但它的靈敏度較低，并且作為一種基于細(xì)胞的檢測(cè)方法，它既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，而且僅限于易于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

    CIRCLE-seq 代表 Circularization for In vitro Reporting of Cleaveage Effects by SEQuencing，它結(jié)合了靈活的體外工作流程和僅選擇性測(cè)序 Cas9 切割的 DNA 的所有富集優(yōu)勢(shì)。1 隨機(jī)剪切的基因組 DNA 被環(huán)化，然后用 Cas9 切割. 只有具有切割位點(diǎn)的分子才會(huì)進(jìn)入文庫(kù)制備、PCR 擴(kuò)增和 NGS 的后續(xù)步驟，以揭示易受 Cas9 切割影響的序列。

     作為一種體外試驗(yàn)，CIRCLE-seq 避免了 CRISPR QC 基于細(xì)胞的方法中冗長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)步驟。此外，CIRCLE-seq 是一種可擴(kuò)展、靈敏的技術(shù)，與其他體外方法相比，需要更少的測(cè)序讀數(shù)，從而降低測(cè)序成本。CIRCLE-seq 的成功需要使用 CRISPR基因編輯試劑等進(jìn)行高效的文庫(kù)制備，可減少文庫(kù)擴(kuò)增過程中擴(kuò)增偏差的高保真 DNA 聚合酶。

   基于 NGS 的工具可在每個(gè)階段對(duì) CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的編輯進(jìn)行核苷酸水平的驗(yàn)證。

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