CRISPR 基因編輯技術(shù)正在推動(dòng)生物技術(shù)的各個(gè)方面，包括分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)生物技術(shù)，甚至食品技術(shù)。自從它被發(fā)現(xiàn)以來，新公司紛紛成立，將 CRISPR 的優(yōu)勢推廣到各個(gè)領(lǐng)域，許多現(xiàn)有的基因編輯公司也開始利用CRISPR 基因編輯 。

什么是 CRISPR？

    CRISPR 代表成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列。CRISPR 是在古細(xì)菌和細(xì)菌等原核生物的基因組中發(fā)現(xiàn)的一組 DNA 序列。CRISPR 序列的特征是相同重復(fù)簇與稱為間隔子的不相同片段間隔開。當(dāng)病毒攻擊原核生物時(shí)，這些原核 DNA 元件就衍生自病毒。隨后，這些 DNA 序列參與針對侵入性遺傳元件（包括病毒和質(zhì)粒）的適應(yīng)性免疫。CRISPR 片段與某些酶一起構(gòu)成了強(qiáng)大的基因編輯系統(tǒng)的基礎(chǔ)。因此，在現(xiàn)代生物學(xué)領(lǐng)域，術(shù)語 CRISPR 更多地表示一種基因組編輯工具，而不僅僅是編碼細(xì)菌免疫力的基因序列。

誰發(fā)現(xiàn)了 CRISPR？

    CRISPR 重復(fù)序列是在 1987 年偶然發(fā)現(xiàn)的，當(dāng)時(shí)是在研究大腸桿菌中負(fù)責(zé)堿性磷酸酶同工酶轉(zhuǎn)化的 IAP 基因時(shí)發(fā)現(xiàn)的。來自大阪大學(xué)的Yoshizumi Ishino等人進(jìn)行了研究，他們發(fā)現(xiàn)了一種奇特的重復(fù)序列，其功能在當(dāng)時(shí)是未知的。在另一項(xiàng)關(guān)于結(jié)核分枝桿菌的獨(dú)立研究中 , 荷蘭的研究人員在不同的結(jié)核分枝桿菌菌株中發(fā)現(xiàn)了直接重復(fù)簇 (DR) 的多樣性。發(fā)現(xiàn) DR 的這種多態(tài)性特征可用于菌株分型，并且一直在使用。大約在同一時(shí)間，西班牙阿利坎特大學(xué)的 Francisco Mojica 和他的團(tuán)隊(duì)在古細(xì)菌的 Haloferax 和 Haloarcula 物種中觀察到了 CRISPR 重復(fù)序列。然而，多年來，這種成簇回文重復(fù)的作用一直是個(gè)謎。

     在 2002 年，Ruud Jansen 和他的團(tuán)隊(duì)創(chuàng)造了 CRISPR 一詞，并報(bào)告了一組分散在緊鄰 CRISPR 位點(diǎn)的簇中的基因。這些基因被稱為 CRISPR 相關(guān) (Cas) 基因。因此，發(fā)現(xiàn)了編碼 Cas1-4 蛋白的前四個(gè) Cas 基因。隨之而來的是，在國際范圍內(nèi)對各種細(xì)菌的CRISPR進(jìn)行了多種研究。這些研究揭示了 CRISPR/Cas 系統(tǒng)在原核生物適應(yīng)性免疫中的作用。

什么是 CRISPR-Cas9？

Cas9（CRISPR 相關(guān)蛋白 9）是一種與化膿性鏈球菌中的 CRISPR 適應(yīng)性免疫相關(guān)的 DNA 核酸內(nèi)切酶。Cas9 是一種 RNA 引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，因此可以切割幾乎任何與引導(dǎo) RNA 互補(bǔ)的 DNA 序列。

CRISPR-Cas9 是如何工作的？

    Cas9 核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)使用兩個(gè)稱為 CRISPR RNA (crRNA) 的小 RNA 分子和兩個(gè)反式激活 CRISPR RNA (tracrRNA)。在天然存在的 CRISPR-Cas 系統(tǒng)中，一旦 crRNA-tracrRNA-Cas9 效應(yīng)復(fù)合物準(zhǔn)備就緒，Cas9 就會(huì)在噬菌體或質(zhì)粒 DNA 序列中尋找特定的原型間隔區(qū)相鄰基序“PAM”。該 PAM 序列僅存在于與原型間隔子本身非常接近的相或病毒 DNA 中，但它并未并入細(xì)菌的 CRISPR 序列中。通過這種方式，CRISPR-Cas9系統(tǒng)識(shí)別新的protospacer并在感染時(shí)識(shí)別入侵者，從而避免自身CRISPR序列的切割并提供針對病毒的免疫力。這也因此成為 CRISPR/Cas9 基因組編輯的基礎(chǔ)。

    Doudna 和 Charpentier 通過將 crRNA 與 tracrRNA 融合（堿基配對）形成雙 RNA 結(jié)構(gòu)來重新設(shè)計(jì) Cas9 核酸內(nèi)切酶，該結(jié)構(gòu)指導(dǎo) Cas9 蛋白引入雙鏈 (ds) 插入靶 DNA。雙 tracrRNA:crRNA 在設(shè)計(jì)為單個(gè) RNA 嵌合體時(shí)，還指導(dǎo)序列特異性 Cas9 dsDNA 切割。也就是說，通過操縱引導(dǎo) RNA 的核苷酸序列，可以對 Cas9 系統(tǒng)進(jìn)行編程以靶向任何 dsDNA 序列進(jìn)行切割。在其他研究中，科學(xué)家們對 CRISPR 系統(tǒng)進(jìn)行了改造，以制造可編程的轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子可以靶向并激活或沉默特定基因，從而使在全基因組范圍內(nèi)對基因表達(dá)進(jìn)行序列特異性控制成為可能。

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