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親和層析原理：親和層析是應(yīng)用生物高分子物質(zhì)能與相應(yīng)專一配基分子可逆結(jié)合的原理，將配基通過共價(jià)鍵牢固地結(jié)合于固相載體上制得親和吸附系統(tǒng)。伴有雜…
親和層析是應(yīng)用生物高分子物質(zhì)能與相應(yīng)專一配基分子可逆結(jié)合的原理，將配基通過共價(jià)鍵牢固地結(jié)合于固相載體上制得親和吸附系統(tǒng)。伴有雜質(zhì)的高分子分離目的物在一定條件下,能以某種次級(jí)鍵與已固定化的配基結(jié)合，而雜質(zhì)則不被吸附。分去雜質(zhì)后更換條件，又可使高分子物質(zhì)重新解離，因而獲得純化。
親和層析更適用于從某些組織勻漿或發(fā)酵液中，分離相對(duì)含量低、雜質(zhì)與純化目的物之間的溶解度、分子大小,電荷分布等物化性質(zhì)差異較小,其它經(jīng)典手段分離有困難的高分子物質(zhì)。因親和層析專一性高,操作簡便，時(shí)間短，得率高,故對(duì)分離某些不穩(wěn)定的高分子物質(zhì)，更具優(yōu)越性。
下圖中圓球表示載體,球上黑色箭頭表示配基。當(dāng)各種不同功能的高分子物質(zhì)(分別以方塊、半圓和三角缺口來表示配基結(jié)合部位)通過時(shí),只有帶三角缺口的高分于物質(zhì)能與固相上的配基專一結(jié)合，其它高分子物質(zhì)則不受阻礙地流出，然后改變洗脫條件使分離目的物解離而洗脫下來。
(2)具有大量可供活化和配基結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)
(3)有稀松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使大分子能自由進(jìn)入。
(4)有較好的化學(xué)穩(wěn)定性，能經(jīng)受親和層析時(shí)所用條件
(6)對(duì)酶及微生物侵蝕穩(wěn)定，價(jià)格合理。
2，蛋白純化親和層析載體簡介
玻璃對(duì)酸堿、有機(jī)溶劑及生物侵蝕非常穩(wěn)定，并且本身義特別堅(jiān)硬,易于化學(xué)鍵合連接分子臂,是一極為理想的載體。但由于價(jià)格昂貴,而且有時(shí)呈現(xiàn)SiOH基的非特異性吸附，這是最大的缺點(diǎn)。由于其應(yīng)用上具極大優(yōu)點(diǎn)，克服缺點(diǎn)方面的研究正在進(jìn)行中
丙烯酰胺和 N,N-甲叉雙丙烯酰胺的共聚物是一種良好的載體。具有三向網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和碳?xì)涔羌苊妫拇罅旷０坊ф湻堑鼓z具有親水性，且可供活化。但在配基偶聯(lián)后網(wǎng)塊縮小不利于親和層析是其缺點(diǎn)。
多糖類載體目前應(yīng)用最廣，纖維素是其中最經(jīng)濟(jì)的一種可作為固相載體的物質(zhì)。但纖維素作為親和層析載體尚有許多缺點(diǎn)，首先活化后會(huì)產(chǎn)生帶電荷的離子而物理結(jié)構(gòu)又較緊密。雖然較小的配基能引入纖維素，但是蛋白和核酸的通透性則受空間位阻所阻礙。因此高度取代的配基并不能保證高容量的吸附，特別是配基和吸附物都是蛋白時(shí)更是如此。
葡聚糖凝膠是用環(huán)氣氯丙烷作為交聯(lián)劑，把多聚葡萄糖交聯(lián)而成的珠狀凝膠。其化學(xué)性能及物理穩(wěn)定性都比較好,但多孔性能較差。最松散的結(jié)構(gòu)如Sephadex G-200，也只能讓分子量6X105的球蛋白通過。在配基偶聯(lián)上去后，凝膠膨脹度將進(jìn)一步縮減，故其應(yīng)用范圍和纖維素載體相同，都有一定的局限性。葡聚糖凝膠只適合與小配基制成親水吸附劑以及免疫吸附系統(tǒng)，由于用在這方面容量和通透性的要求都不高，一般較常用。(5)瓊脂糖凝膠和交聯(lián)瓊脂糖凝膠載體
瓊脂糖凝膠是由D-半乳糖和3,6-脫水-半乳糖相間結(jié)合的鏈狀多糖。它高度親水，具有極松散網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),可以讓上百萬分子量的大分子通過。物理和化學(xué)性能都比較穩(wěn)定。通過溴化氰及環(huán)氧乙烷類試劑活化,引入活性基團(tuán),并在極溫和條件下連接上較多配基,吸附量較大。在非專一吸附方面，如果緩沖液離子濃度不太高，它對(duì)蛋白質(zhì)幾平?jīng)]有吸附作用，在室溫用1mol/L的強(qiáng)酸或強(qiáng)堿處理2~3h不會(huì)引起顆粒性質(zhì)的變化。用較濃的尿素或鹽酸胍長期處理，亦不引起吸附性能的減弱，即使用蛋白變性劑徹底洗脫大分子物質(zhì)亦不致引起破壞，這就保證了吸附劑可以反復(fù)使用。珠狀瓊脂糖凝膠的缺點(diǎn)是它不能象葡聚糖凝膠一樣進(jìn)行干燥和凍干，且經(jīng)不起有機(jī)溶劑處理，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑處理可引起珠狀凝膠嚴(yán)重不可逆碎裂。因此人們就用類似葡聚糖凝膠的交聯(lián)方法發(fā)展出另一更為理想的交聯(lián)瓊脂糖凝膠，它具有上述凝膠的優(yōu)點(diǎn)面減少其缺點(diǎn)。
三，親和吸附和洗脫
純化蛋白質(zhì)的親和層析基本用柱法。在上柱時(shí)應(yīng)選擇配基和目的物之間作用最強(qiáng)的離子強(qiáng)度和pH組成,使最有利于形成親和絡(luò)合物，一般則選取中性pH作為吸附條件。樣品應(yīng)溶于親和層析柱的平衡緩沖液中,或用平衡緩沖液進(jìn)行透析。上柱速度盡可能慢，對(duì)溫度不敏感的物質(zhì)，室溫純化即可；對(duì)溫度敏感的物質(zhì)，可以采用在4℃下純化，通常的親和層析圖譜如下圖。
樣品上柱后分離目的物先緊密地吸附在親和柱上,用平衡緩沖液洗滌時(shí)層析譜上出現(xiàn)第一個(gè)雜蛋白的峰。繼續(xù)用大量平衡緩沖液充分洗滌，必要時(shí)用不同緩沖液洗滌以除去非專一吸附的雜質(zhì),使柱上只留下專一吸附的目的物。然后改變緩沖液，要求選擇能減弱純化目的物與親和吸附劑之間吸附力的條件,使絡(luò)合物解離洗出，圖譜上出現(xiàn)第二個(gè)峰。一般洗脫方法是改變緩沖液的pH，改變離子強(qiáng)度或同時(shí)改變兩者。洗脫蛋白質(zhì)大多數(shù)用0.1mol/L稀醋酸或0.01mol/L稀鹽酸，如果目的物會(huì)被酸破壞，可使用0.1mol/L氫氧化銨洗脫。蛋白質(zhì)洗出后應(yīng)立刻中和、稀釋透析、重折疊為天然結(jié)構(gòu)恢復(fù)蛋白質(zhì)活性。
除改變緩沖液pH作為洗脫方法以外，尚有用可溶性配基作競爭性洗脫。例如用較高濃度的抑制劑、輔酶或底物,競爭洗脫酶。用各種糖或低聚糖苷從固定化的植物凝集素親和吸附系統(tǒng)上洗脫專一吸附的糖蛋白目的物。用這類洗脫劑的優(yōu)點(diǎn)還在于它又一次地利用了生物專一性。但這種洗脫方法所得蛋白質(zhì)溶液往往較稀，并含有可溶性洗脫劑，這可以用透析和凝膠過濾法除去。有些抗原和抗體結(jié)合力特別強(qiáng)，上述方法有時(shí)尚不能洗脫則可試用鹽酸胍、尿素等蛋白促溶劑作為洗脫劑，洗脫的蛋白在適當(dāng)處理后能恢復(fù)活力者才適用。當(dāng)分離目的物洗脫下來后可連續(xù)使用大量洗脫液洗滌親和柱，再用平衡緩沖液使親和柱充分平衡，經(jīng)過這樣處理，親和柱就可以重復(fù)使用。
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