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蛋白酶體是蛋白質合成過程中錯誤折疊的蛋白質和其他蛋白質被蛋白酶解的主要降解途徑。蛋白酶體抑制劑也被稱為蛋白酶抑制劑 是廣泛用于癌癥的輔助藥物。
蛋白酶體存在于所有真核細胞、古細菌和一些細菌中。它是一種多催化蛋白酶，由多種催化和調節(jié)蛋白組成。它具有三種或四種不同的肽酶活性，包括胰蛋白酶樣、糜蛋白酶樣和肽基谷氨酰肽水解活性。大多數蛋白質在蛋白酶體降解之前被泛素化。據估計，大約 20% 的 26S 蛋白酶體在沒有蛋白質毒性應激的情況下參與蛋白質降解。
圖 1.泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的示意圖。
蛋白酶抑制劑作為癌癥的輔助藥物，并在實驗室研究中得到廣泛應用。Bortezomib，也稱為 PS-341、Velcade 和 MG-341，是 經FDA 批準的用于骨髓瘤和套細胞淋巴瘤的藥物。還經常用于實驗室實驗以抑制蛋白酶體活性。其他幾種蛋白酶體抑制劑也正在研究測試，包括雙硫侖、表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯、鹽孢菌胺 A、卡非佐米、ONX 0912、CEP-18770 和 MLN9708等。
常用的蛋白酶體抑制劑的主要特征
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抑制劑 |
機制 |
應用 |
貯存 |
備注 |
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MG132 |
可逆的 |
~10uM，1 小時 |
-20°C |
較便宜，還抑制 NF-kB 激活 (IC50 = 3 uM) 和鈣蛋白酶 |
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乳胞素 |
不可逆轉 |
~10 微米，2 小時 |
-20°C |
稍貴，還抑制 NF-kB 活化，比 MG132 更具蛋白酶體活性特異性 |
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蛋白酶體抑制劑 I |
可逆的 |
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-20°C |
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表 2。蛋白酶體抑制劑的主要特征、處理濃度、儲存、實驗室研究
MG132
MG132，也稱為carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinal，Z-LLL-CHO，是一種肽醛，是一組能夠抑制不同類型蛋白酶的化學物質之一，包括絲氨酸蛋白酶、鈣蛋白酶等. MG132 和其他肽醛已被證明能強烈抑制蛋白酶體的多種肽酶活性和鈣蛋白酶活性 。
MG132蛋白酶抑制劑的應用
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細胞類型 |
備注（處理時間/濃度） |
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A. polyphaga細胞, HEK293 細胞 |
0.1 uM，感染前 1 小時并始終保持 |
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A431 細胞 |
10 微米 |
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擬南芥原生質體 |
1-10 微米，2 小時 |
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COS-7 細胞 |
25 微米，5 小時 |
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COS-7，海拉細胞 |
20 微米，24 小時 |
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H1299、HeLa、U2OS 細胞 |
10 微米，12 小時 |
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海拉細胞 |
20 毫米，24 小時 |
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HEK293 細胞 |
20 微米，3-6 小時 |
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HEK293 細胞 |
1 微米，16 小時 |
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HEK293T細胞 |
50 uM，4 到 7 小時 |
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乳腺上皮細胞 |
10 微米，4 小時 |
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RAW 264.7 單元格 |
50 uM，3 到 6 小時 |
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酵母 |
60 uM ，至少四個小時 |
表 1。上表中表示 MG132 應用（處理時間和濃度）。
蛋白酶體是細胞功能的組成部分。MG132 和其他蛋白質體抑制劑對細胞和組織有毒性，在高濃度或長時間感染后會導致細胞死亡。建議在一定范圍內滴定適宜濃度（例如，1000x）。適宜濃度不僅取決于特定的細胞類型，還取決于細胞培養(yǎng)參數，例如細胞匯合度、血清濃度和培養(yǎng)基成分。
MG132 應儲存在 -20°C，可溶解在 DMSO (10 mg/ml) 或甲醇 (1 mg/ml) 中，分裝并儲存在 -20 或 -80°C。如果 MG132 DMSO 溶液在添加到培養(yǎng)基中時產生沉淀，可以將 DMSO 原液加熱至 40°C。
圖 2. MG132 的化學結構。
乳胞素
Lactacystin 是一種抗生素，從鏈霉菌中分離出來，現在可以化學合成。它在細胞和體內水解成 clasto-lactacystin beta-lactone，這可能是共價修飾哺乳動物 20S 蛋白酶體中 X 亞基的 N 末端蘇氨酸的活性抑制劑。共價結合是特異性的，因此它不會影響半胱氨酸或絲氨酸蛋白酶，其表現比肽醛（如 MG132）好。
圖 3. lactacystin 的化學結構。
Lactacystin 可以在細胞培養(yǎng)中以 10 uM、25 uM 使用數小時。
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細胞類型 |
感染時長及濃度 |
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BxPC-3 |
10 uM, 12, 24, 48 小時 |
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HEK-293T 細胞 |
25 uM，4 到 7 小時；10 微米，10 小時 |
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RAW 264.7 單元格 |
10 微米，2 小時 |
表 2。表格中為 lactacystin 應用示例（處理時間和 lactacystin 濃度）。
lactacystin常用于研究桿菌水腫毒素對核糖原合酶激酶 3beta 的影響，以及研究 LRRK2 泛素化和降解的調節(jié)。
蛋白酶體抑制劑 I
蛋白酶體抑制劑 I (PSI)用于孵育轉染細胞和 Peptide Institute 蛋白酶體抑制劑 PSI (N-carbobenzoxy-L-isoleucyl-L-gamma-t-butyl-L-glutamyl-L-alanyl-L- leucinal) 用于處理細胞。
Velcade（PS-341、MG-341、硼替佐米）在實驗室實驗中用于抑制蛋白酶體活性。Velcade 細胞毒性已檢測。實驗中用 50 uM/L Velcade 處理 8 小時的 HEK-293 細胞沒有明顯的細胞損失。而使用濃度在 0.5 至 50 μmol/L 的Velcade 長時間孵育（24 小時）導致約 40% 的細胞死亡 。
XAV 939
ADP-核糖基 轉移酶tankyrase (TNKS) 對PI31 的ADP-核糖基化抑制PI31 的20S 抑制，從而促進26S 蛋白酶體活性。 XAV939是一種 TNKS 的小分子抑制劑，可阻斷 PI31 ADP-核糖基化。
蛋白酶體抑制的驗證
使用蛋白酶體抑制的主要目的就是降低蛋白酶體活性的減弱。一般通過以下兩種方法進行驗證：一是通過Suc-LLVY-AMC（N-succinyl-L-leucyl-L-leucyl-L-leucyl-7-amido-4-methylcoumarin）作為熒光蛋白酶體活性指示劑。泛素融合降解底物 Ub-G76V-GFP 在蛋白酶體抑制時發(fā)出熒光。另一種方法是通過蛋白質印跡檢查單泛素和多泛素部分水平之間的比率。如果蛋白酶體活性受到抑制，則應該有較低水平的單泛素。
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