標(biāo)簽：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù) 生物反應(yīng)器 

抗體是具有免疫活性的糖蛋白結(jié)構(gòu)。當(dāng)它們識(shí)別細(xì)菌、病毒或腫瘤細(xì)胞等異物時(shí)，它們能夠識(shí)別或誘導(dǎo)中和免疫反應(yīng)。免疫球蛋白由 B 淋巴細(xì)胞響應(yīng)抗原的存在而產(chǎn)生和分泌。目前，單克隆抗體技術(shù)(mAb) 主要是從這些細(xì)胞的培養(yǎng)中產(chǎn)生的。其需求的培養(yǎng)條件如下：

培養(yǎng)基的要求

哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基必須含有復(fù)雜的成分，從氨基酸到微量元素。為了滿足細(xì)胞對(duì)這些營(yíng)養(yǎng)素的需求，培養(yǎng)基在其成分中使用血清，然而，由于缺陷朊病毒引起的疾病的出現(xiàn)，例如牛海綿狀腦炎 (BSE)，因此有很大的動(dòng)機(jī)去除任何動(dòng)物成分培養(yǎng)基成分，特別是如果培養(yǎng)基用于生物制藥產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)。這導(dǎo)致了不含任何動(dòng)物成分的培養(yǎng)基的出現(xiàn)，包括用于 CHO 和 NS0 的明確培養(yǎng)基，這是 mAb 生產(chǎn)中常用的兩種細(xì)胞類型。由于開(kāi)發(fā)合適的培養(yǎng)基成本較高好。所以，許多公司喜歡開(kāi)發(fā)自己的生產(chǎn)培養(yǎng)基來(lái)維持生產(chǎn)批次之間的成分，并為將要使用的特定細(xì)胞類型開(kāi)發(fā)合適的培養(yǎng)基成分，并實(shí)現(xiàn)對(duì)生產(chǎn)的更大控制。除此之外，開(kāi)發(fā)滿足高純度產(chǎn)品要求的下游工藝和驗(yàn)證最終產(chǎn)品質(zhì)量的測(cè)試會(huì)提高基于單克隆抗體的藥物的總體生產(chǎn)成本。盡管開(kāi)發(fā)培養(yǎng)基很復(fù)雜，但在這一領(lǐng)域已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，允許在合適的條件下進(jìn)行更大的細(xì)胞生長(zhǎng)并增加細(xì)胞保存時(shí)間，以促進(jìn)目標(biāo)分子的生長(zhǎng)和生產(chǎn) 。

培養(yǎng)條件的要求

細(xì)胞生長(zhǎng)條件可以直接影響感興趣分子的細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)水平。通常，用于 mAb 生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件非常明確：37 °C、pH 7.15 和30–60% 的溶解 O 2 (OD) 水平。二氧化碳2監(jiān)測(cè)水平以模擬 31 至 54 mmHg 之間的生理標(biāo)準(zhǔn)。然而，細(xì)胞條件的變化已顯示出改變細(xì)胞代謝向細(xì)胞生長(zhǎng)或分子產(chǎn)生的巨大潛力，這可用于增加 mAb 的產(chǎn)生。生物過(guò)程可以設(shè)計(jì)為分兩個(gè)階段進(jìn)行。首先，優(yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)以達(dá)到一定的細(xì)胞密度。一旦達(dá)到這個(gè)密度，第二階段就開(kāi)始了，生物反應(yīng)器的條件發(fā)生了變化，因此細(xì)胞繼續(xù)以維持速率生長(zhǎng)，并將新陳代謝引導(dǎo)向單克隆抗體的產(chǎn)生。一些 CHO 細(xì)胞株和雜交瘤細(xì)胞對(duì)溫度和 pH 值的變化很敏感。當(dāng)溫度和 pH 值低于通常使用的值時(shí)，值分別在 30 到 35°C 和 6.7-7.0 之間，細(xì)胞生長(zhǎng)代謝減少，比產(chǎn)量增加。生長(zhǎng)代謝減少還有助于降低某些對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物有毒的代謝化合物的產(chǎn)生，從而提高細(xì)胞活力，從而花費(fèi)更多時(shí)間產(chǎn)生感興趣的分子。監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)階段以控制培養(yǎng)變化的一個(gè)好方法是觀察 DO 和 pCO2 個(gè)水平，也可以對(duì)其進(jìn)行調(diào)整，以最大限度地提高 mAb 等蛋白質(zhì)的產(chǎn)量 。

單克隆抗體生產(chǎn)工藝

用于 mAb 生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)可以遵循三種不同類型的過(guò)程。其中較簡(jiǎn)單的是批量生產(chǎn)，它由一個(gè)封閉系統(tǒng)組成，在該系統(tǒng)中，生物反應(yīng)器被滅菌并用含有細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)品制造所需的所有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基制備，然后接種細(xì)胞。沒(méi)有新鮮培養(yǎng)基的進(jìn)料系統(tǒng)或用過(guò)的培養(yǎng)基的退出。隨著過(guò)程的進(jìn)行，營(yíng)養(yǎng)濃度降低并產(chǎn)生廢物代謝物，從而降低細(xì)胞活力。

在此過(guò)程之中過(guò)程由于反應(yīng)器內(nèi)的環(huán)境很快變得不利于細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)廢物濃度增加。初始營(yíng)養(yǎng)濃度和代謝廢物產(chǎn)生等培養(yǎng)因素直接決定了細(xì)胞在浴培養(yǎng)中可以達(dá)到的MAX濃度。通常，這種培養(yǎng)方式的MAX密度為 1-2 × 106細(xì)胞/mL，然后細(xì)胞活力迅速下降。生產(chǎn)過(guò)程持續(xù) 4-7 天，當(dāng)生產(chǎn)力達(dá)到一定的關(guān)注濃度時(shí)。收集上清液并通過(guò)下游工藝回收產(chǎn)品。每批完成所需的時(shí)間還取決于生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)。如果生產(chǎn)依賴于生長(zhǎng)（生產(chǎn)與細(xì)胞生長(zhǎng)同時(shí)發(fā)生），則可以在細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定期后立即停止批處理。

與分批相比，使用的第二種生產(chǎn)過(guò)程是連續(xù)發(fā)酵。有兩種類型的連續(xù)生產(chǎn)：恒化器培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)。關(guān)于恒化器培養(yǎng)，將新鮮培養(yǎng)基添加到生物反應(yīng)器中，并以恒定流速將發(fā)酵培養(yǎng)基與細(xì)胞一起去除，以使培養(yǎng)體積保持不變。流速（稀釋率）控制細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)這兩個(gè)變量相等時(shí)，生物反應(yīng)器達(dá)到平衡——細(xì)胞濃度、營(yíng)養(yǎng)濃度和產(chǎn)品濃度保持恒定。在這種情況下，培養(yǎng)物可以保持平衡數(shù)月，達(dá)到 10-30 × 10 6 個(gè)細(xì)胞/mL  。

為了避免活細(xì)胞損失以及細(xì)胞代謝副產(chǎn)物的不斷流出，許多制造廠開(kāi)發(fā)了細(xì)胞回收系統(tǒng)，因此開(kāi)發(fā)了灌注培養(yǎng)方法，將細(xì)胞保存在生物反應(yīng)器內(nèi)。連續(xù)發(fā)酵的缺點(diǎn)是會(huì)使用大量昂貴的培養(yǎng)基和難以回收的產(chǎn)品，產(chǎn)品過(guò)度稀釋。為了解決產(chǎn)品稀釋問(wèn)題，一些生產(chǎn)制造廠有超濾系統(tǒng)，將產(chǎn)品保留在生物反應(yīng)器內(nèi) 。此類過(guò)程的另一個(gè)障礙是，為穩(wěn)定的工業(yè)生產(chǎn)工廠建立培養(yǎng)條件可能需要數(shù)月時(shí)間。為此，所使用的菌株必須非常穩(wěn)定，并清楚地闡明其生理方面，例如生長(zhǎng)速率、生產(chǎn)力和對(duì)某些壓力條件的反應(yīng)。在穩(wěn)定的生產(chǎn)工廠落戶之前，多次嘗試的情況并不鮮見(jiàn)，但是一旦落戶，這種生產(chǎn)過(guò)程可以帶來(lái)許多優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗梢栽诟◇w積的生物反應(yīng)器中運(yùn)行，因此具有更大的生產(chǎn)靈活性。

第三種生產(chǎn)單克隆抗體的工藝是迄今為止工業(yè)規(guī)模使用較多的工藝，即分批補(bǔ)料工藝。在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞密度達(dá)到 8-12 × 10 6 個(gè)細(xì)胞/mL，并且通過(guò)在指定的時(shí)間間隔內(nèi)控制營(yíng)養(yǎng)添加來(lái)提高生物反應(yīng)器中的細(xì)胞活力[。生產(chǎn)過(guò)程可能需要 12-20 天。通常，初始培養(yǎng)中使用的相同培養(yǎng)基也用于飼喂，但濃度更高?？梢栽O(shè)計(jì)補(bǔ)料溶液組合物，通過(guò)分析和識(shí)別消耗更多的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物，根據(jù)細(xì)胞在不同培養(yǎng)階段的代謝狀態(tài)來(lái)供應(yīng)細(xì)胞。此外，可以修改用于喂養(yǎng)的培養(yǎng)基以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或刺激分子產(chǎn)生，因?yàn)椴煌某煞挚赡軙?huì)改變細(xì)胞的行為，從而改變新陳代謝以達(dá)到不同的目的。進(jìn)料溶液還可以設(shè)計(jì)為最大限度地減少過(guò)量代謝物的產(chǎn)生，這些代謝物會(huì)在過(guò)量時(shí)引起細(xì)胞應(yīng)激。

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