當(dāng)您聽(tīng)到“克隆”一詞時(shí)，您可能會(huì)想到克隆整個(gè)生物體，例如綿羊多利。然而，克隆某物的全部意思就是制作它的基因精確副本。在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，常被克隆的是基因或其他小片段DNA 稱(chēng)為DNA克隆。

DNA克隆技術(shù)概述

 DNA 克隆技術(shù)其實(shí)就是基因編輯，是指制作特定 DNA 片段的多個(gè)相同副本的過(guò)程。在典型的 DNA 克隆過(guò)程中，通常會(huì)將目的的基因或其他 DNA 片段插入稱(chēng)為質(zhì)粒的環(huán)狀 DNA 片段中。插入是使用“剪切和粘貼”DNA 的酶完成的，它會(huì)產(chǎn)生一個(gè)重組 DNA分子，或由多個(gè)來(lái)源的片段組裝而成的 DNA。

 質(zhì)粒 DNA 的環(huán)狀片段在其末端具有與基因片段相匹配的突出端。質(zhì)粒和基因片段連接在一起，產(chǎn)生含有基因的質(zhì)粒。這種含有基因的質(zhì)粒是重組 DNA 的一個(gè)例子，或由多種來(lái)源的 DNA 組裝而成的 DNA 分子。

 接下來(lái)，將重組質(zhì)粒引入細(xì)菌。選擇并培養(yǎng)攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌。當(dāng)它們繁殖時(shí)，它們會(huì)復(fù)制質(zhì)粒并將其傳遞給它們的后代，從而復(fù)制其中包含的 DNA。

在質(zhì)粒中復(fù)制多個(gè) DNA 序列有什么意義？

在某些情況下，我們需要大量 DNA 拷貝來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或構(gòu)建新的質(zhì)粒。在其他情況下，DNA 片段編碼一種有用的蛋白質(zhì)，細(xì)菌被用作制造蛋白質(zhì)的“工廠”。例如，人類(lèi)胰島素基因在大腸桿菌中表達(dá)，來(lái)制造胰島素。

DNA克隆的基本步驟

1.切開(kāi)質(zhì)粒并“粘貼”到基因中。這個(gè)過(guò)程依賴于限制酶（切割 DNA）和 DNA 連接酶（連接 DNA）。

2.將質(zhì)粒插入細(xì)菌。使用抗生素選擇來(lái)識(shí)別占用質(zhì)粒的細(xì)菌。

3.培養(yǎng)大量攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌，并將它們用作制造蛋白質(zhì)的“工廠”。從細(xì)菌中收獲蛋白質(zhì)并純化。

讓我們仔細(xì)看看每一步。

1. 剪切和粘貼 DNA

不同來(lái)源的 DNA 片段如何連接在一起？一種常用的方法使用兩種類(lèi)型的酶：限制酶和 DNA 連接酶。

限制酶是一種可識(shí)別特定的目標(biāo)序列的DNA 切割酶，許多限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生帶有短單鏈懸垂的切割末端。如果兩個(gè)分子有匹配的懸垂，它們可以堿基配對(duì)并粘在一起。然而，它們不會(huì)結(jié)合形成一個(gè)完整的 DNA 分子，直到它們被DNA 連接酶連接起來(lái) ，DNA 連接酶密封了 DNA 骨架中的缺口。我們克隆的目標(biāo)是將目標(biāo)基因（例如，人胰島素）插入質(zhì)粒。

   我們從一個(gè)環(huán)形細(xì)菌質(zhì)粒和一個(gè)目標(biāo)基因開(kāi)始。目標(biāo)基因的兩端是限制位點(diǎn)，或特定限制酶識(shí)別的 DNA 序列。在質(zhì)粒中，還有一個(gè)被同一種酶識(shí)別的限制性位點(diǎn)，就在將驅(qū)動(dòng)細(xì)菌表達(dá)的啟動(dòng)子之后。

   質(zhì)粒和靶基因都（分別）用限制酶消化。純化并合并片段。它們具有匹配的“粘性末端”或單鏈 DNA 懸垂，因此它們可以粘在一起。

DNA 連接酶將具有匹配末端的片段連接在一起，形成一個(gè)完整的 DNA 分子。這會(huì)產(chǎn)生包含目標(biāo)基因的重組質(zhì)粒。

2. 細(xì)菌轉(zhuǎn)化與選擇

  質(zhì)粒和其他 DNA 可以在稱(chēng)為轉(zhuǎn)化的過(guò)程中引入細(xì)菌，例如實(shí)驗(yàn)室中使用的無(wú)害大腸桿菌。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，特別準(zhǔn)備的細(xì)菌細(xì)胞會(huì)受到?jīng)_擊（如高溫），促使它們吸收外來(lái) DNA。

    將通過(guò)連接產(chǎn)生的 DNA（可能是所需質(zhì)粒、副產(chǎn)物質(zhì)粒和線性 DNA 片段的混合物）添加到細(xì)菌中。細(xì)菌受到熱休克，這使它們更容易通過(guò)轉(zhuǎn)化吸收 DNA。然而，只有極少數(shù)細(xì)菌能成功地?cái)z取質(zhì)粒。

   質(zhì)粒通常包含抗生素抗性基因，它允許細(xì)菌在特定抗生素存在的情況下存活。因此，可以在含有抗生素的營(yíng)養(yǎng)平板上選擇吸收質(zhì)粒的細(xì)菌。沒(méi)有質(zhì)粒的細(xì)菌會(huì)死亡，而攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌可以存活和繁殖。每一個(gè)存活下來(lái)的細(xì)菌都會(huì)產(chǎn)生一個(gè)小的、點(diǎn)狀的群體或菌落，它們都是相同的細(xì)菌，它們都攜帶相同的質(zhì)粒。

    并非所有菌落都必然包含正確的質(zhì)粒。這是因?yàn)?，在連接過(guò)程中，DNA 片段并不總是按照我們預(yù)期的方式“粘貼”。相反，我們必須從幾個(gè)菌落中收集 DNA，看看每個(gè)菌落是否含有正確的質(zhì)粒。限制酶消化和PCR等方法通常用于檢查質(zhì)粒。

3. 蛋白質(zhì)表達(dá)

   一旦我們找到了一個(gè)帶有正確質(zhì)粒的細(xì)菌菌落，我們就可以培養(yǎng)大量含有質(zhì)粒的細(xì)菌。然后，我們給細(xì)菌一個(gè)化學(xué)信號(hào)，指示它們制造目標(biāo)蛋白質(zhì)。

   細(xì)菌充當(dāng)微型“工廠”，大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)。例如，如果我們的質(zhì)粒含有人胰島素基因，細(xì)菌就會(huì)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄該基因并翻譯 mRNA 以產(chǎn)生許多人胰島素蛋白質(zhì)分子。

   選定的菌落在大型培養(yǎng)物（例如 1 升培養(yǎng)瓶）中長(zhǎng)大。大型培養(yǎng)物中的細(xì)菌被誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒中包含的基因，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄成 mRNA，然后將 mRNA 翻譯成蛋白質(zhì)。由該基因編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)菌內(nèi)部積累。

   一旦產(chǎn)生了蛋白質(zhì)，細(xì)菌細(xì)胞就可以裂開(kāi)釋放出來(lái)。除了目標(biāo)蛋白（如胰島素）外，細(xì)菌中還漂浮著許多其他蛋白質(zhì)和大分子。因此，目標(biāo)蛋白必須經(jīng)過(guò)純化，或者通過(guò)生化技術(shù)從細(xì)胞的其他內(nèi)容物中分離出來(lái)。純化的蛋白質(zhì)可用于實(shí)驗(yàn)，或者在胰島素的情況下，可用于患者。

DNA克隆的用途

通過(guò)克隆技術(shù)構(gòu)建的 DNA 分子在分子生物學(xué)中有多種用途。主要包括：·

1.生物制藥：

DNA克隆可用于制造具有生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的人類(lèi)蛋白質(zhì)，例如上面提到的胰島素。重組蛋白的其他例子包括人類(lèi)生長(zhǎng)激素，用于無(wú)法合成激素的患者，以及組織纖溶酶原激活劑 (tPA)，用于預(yù)防血栓。像這樣的重組蛋白通常是在細(xì)菌中產(chǎn)生的。

2.gene therapy：

 在某些遺傳病中，患者缺乏特定基因的功能形式。例如，DNA 克隆被用于構(gòu)建含有在囊性纖維化中無(wú)功能的正?；虬姹镜馁|(zhì)粒。當(dāng)質(zhì)粒被輸送到囊性纖維化患者的肺部時(shí)，肺功能惡化的速度減緩.

3.基因分析：

在基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室中，生物學(xué)家經(jīng)常使用 DNA 克隆來(lái)構(gòu)建基因的人工重組版本，以幫助他們了解生物體中正?；虻墓δ堋?

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