文章標簽: 緩沖液 dna提取 蛋白質(zhì) 乙醇 色譜柱 試劑

不了解 DNA提取試劑盒的工作原理？我們在本文中介紹了基礎(chǔ)知識，因此您可以完善您的核酸分離并獲得高質(zhì)量的 DNA。

DNA提取是分子生物學實驗中必不可少的基礎(chǔ)實驗步驟。因為我們在分子生物學中所做的幾乎所有事情在開始都需要 DNA 或 RNA，無論是 qPCR、分子克隆、下一代測序還是其他任何東西。 

如今，大多數(shù)實驗室都使用商業(yè) DNA 提取試劑盒，這些試劑盒使用硅膠自旋過濾法來獲得高質(zhì)量的 DNA。這些可以快速有效地純化 DNA（或 RNA）。但這確實意味著很多人只是按照說明操作，并不了解 DNA 提取試劑盒的工作原理。

為什么要了解核酸提取試劑盒的工作原理？ 

離心柱包含一種硅膠樹脂，可根據(jù)鹽條件和受提取方法影響的其他因素選擇性地結(jié)合 DNA 和 RNA。這些 DNA 提取試劑盒使整個過程比舊的 DNA 分離方法更容易、更快。但是，使用套件的缺點是，如果您不了解套件的黑匣子中的內(nèi)容，則會使故障排除變得更加困難。

因此，在本文中，我將詳細解釋 DNA 提取試劑盒的工作原理以及每一步的操作。

我還將討論在 DNA 提取中使用硅膠柱的一些常見問題，只要稍微了解一下就可以克服或避免這些問題。

一、 RNA和DNA提?。?/span>

裂解：裂解公式可能因您要提取 DNA 還是 RNA 而異，但共同點是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。

Chaotropes（離液劑）的作用：Chaotrope會破壞氫鍵及疏水間的相互作用。離液鹽包括鹽酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸鋰。

洗滌劑：除了離液劑外，裂解緩沖液中通常還有一些去污劑，以幫助蛋白質(zhì)溶解和裂解。

溶菌酶和蛋白酶K:根據(jù)樣品類型，也可以使用酶進行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一，實際上在這些變性緩沖液中效果較 好；當?shù)鞍踪|(zhì)變性增多，蛋白酶 K 的作用也會相應(yīng)增強。然而，溶菌酶在變性中不起作用，因此溶菌酶處理通常在添加變性鹽之前進行。

二、關(guān)于質(zhì)粒制備的注意事項

分離質(zhì)粒 DNA 與提取 RNA 或 基因組 DNA 的提取方式是不相同的，因為必須質(zhì)粒與基因組 DNA 必須分離。如果此刻， 您加入離液劑將立即釋放所有物質(zhì)，并且無法將小環(huán)狀 DNA 與高分子量染色體區(qū)別開來。因此，在質(zhì)粒制備過程中中，直到裂解后才加入離液劑，鹽用于結(jié)合。

三、DNA 提取后純化：將 DNA 與色譜柱結(jié)合

離液鹽對于裂解至關(guān)重要，而且對于將 DNA（或 RNA）與色譜柱結(jié)合也是如此。此外，為了增強和影響核酸與二氧化硅的結(jié)合，還添加了酒精。

大多數(shù)情況下這是乙醇，但有時可能是異丙醇。乙醇百分比和體積有很大的影響。太多，你會帶入大量降解的核酸和小物種，這會影響 A260 讀數(shù)并降低你的一些產(chǎn)量。太少，可能難以從膜上洗掉所有鹽分。

如果您在裂解中使用含有 SDS 的去污劑，請嘗試使用NaCl 作為沉淀劑， 以避免去污劑污染 DNA 或 RNA。

四、洗滌 DNA（或 RNA）

當裂解物通過硅膠膜進行離心分離，現(xiàn)在所提取的 DNA 或 RNA 應(yīng)該與柱子結(jié)合，雜質(zhì)、細胞蛋白和多糖應(yīng)該已經(jīng)通過了。  

但是，膜仍然被殘留的細胞蛋白質(zhì)和鹽弄臟。如果樣品來自植物，仍然會有多糖，也許一些色素留在膜上，或者如果樣品是血液，膜可能會被染成棕色或黃色。

洗滌步驟用于去除這些雜質(zhì)。

通常有兩次洗滌，盡管這可能因樣品類型而異。第一次洗滌通常會含有少量的離液鹽，以去除蛋白質(zhì)和有色污染物。這之后總是用乙醇洗滌以除去鹽。

如果開始的準備工作沒有大量蛋白質(zhì)，例如質(zhì)粒準備或 PCR 清理，則只需要乙醇洗滌。去除離液鹽對于獲得高產(chǎn)量和高純度的 DNA 或 RNA 至關(guān)重要。一些試劑盒甚至會用乙醇清洗柱子兩次。如果殘留鹽分，核酸的洗脫會很差，A230讀數(shù)會很高，導(dǎo)致260/230的比率很低。對于無乙醇 DNA 和 RNA，需要進行干法離心，乙醇洗滌后，大多數(shù)方案都有一個離心步驟來干燥柱子。這是為了去除乙醇，對于清潔的洗脫液是必不可少的。  當將 10 mM Tris 緩沖液或水應(yīng)用于膜進行洗脫時，核酸會水合并從膜中釋放出來。如果色譜柱上仍有乙醇，則核酸無法完全再水合。如果跳過干燥步驟會導(dǎo)致乙醇污染和低產(chǎn)量。很可能在 Nanodrop 上看不到 乙醇吸光度，所以它不會出現(xiàn)在您的讀數(shù)中。

五、RNA 和 DNA 提取：洗脫

DNA 提取方案的還剩余的步驟就是從硅膠中釋放純 DNA 或 RNA。

對于使用DNA提取試劑盒進行DNA制備，通常使用 pH 值為 8-9 的 10 mM Tris。DNA 在弱堿性 pH 值下更穩(wěn)定，在緩沖液中溶解得更快。即使對于 DNA 顆粒也是如此。水的 pH 值往往較低，低至 4-5，并且高分子量 DNA 在用于洗脫的短時間內(nèi)可能無法完全再水合。

通過在離心前讓緩沖液在膜中停留幾分鐘，可以較大限度地洗脫 DNA。

由于RNA 易溶于水，且RNA 利于處在微酸性的 pH 值環(huán)境下。

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