單細胞測序技術在遺傳學和蛋白質組學的應用

單細胞測序技術在通量、成本和功效方面的持續(xù)進步使得對大量單個細胞的分析變得可行?，F(xiàn)在可以針對單個細胞分析生物學中心法則的所有關鍵分子，包括 DNA、RNA（在細胞和細胞核中）和蛋白質組學。

單細胞遺傳信息分析涉及三個關鍵步驟：分離或分類、裂解和分析。排序過程可以使用單細胞測序技術進行。方法的選擇取決于研究領域和主題。單細胞測序的排序方法都依賴于已經(jīng)解離的細胞；然而，激光顯微切割和玻璃毛細管等方法也可以從指定的組織區(qū)域收獲細胞。激光顯微切割具有作為顯微鏡技術的優(yōu)勢，并且允許在分離之前進行視覺細胞選擇。該技術在細胞來源方面也是通用的，適用于細胞懸浮液和組織樣本。由熱穩(wěn)定聚合物組成的轉移膜與細胞源接觸放置。用顯微鏡識別靶細胞，激光通過緊鄰的短脈沖“切割”細胞，激活轉移膜，導致粘著斑形成。細胞粘附后，可以去除薄膜并完成額外的處理。

表 3?；蚪M篩選方法分析。

細胞分離后，必須獲得感興趣的分子以進行進一步的下游處理，例如擴增。對于使用微流體方法獲得的細胞，化學裂解是常見的方法。裂解試劑選擇的重要原則是確保它不會干擾目標分子或對放大和分析階段的酶或緩沖液產生負面影響。對于裂解液的選擇還有一個因素也要考慮，那就是可能需要特殊的儀器來確保在操作過程中不會丟失微量的樣品。例如，實驗中使用低吸附的移液器吸頭進行移液，以避免單細胞全基因組亞硫酸氫鹽測序過程中的 DNA損傷。

單細胞基因表達譜的確定依賴于逆轉錄酶定量 PCR (RT-qPCR) 和 RNA FISH) 。由于發(fā)現(xiàn)三分之二的基因組轉錄為 RNA，但許多轉錄本不編碼蛋白質。非編碼轉錄物被認為起著關鍵的調節(jié)作用。所以，RNA 的細胞位置對基因表達至關重要 。在一個細胞系的幾個細胞區(qū)室中進行的研究得出結論，大多數(shù)剪接是在轉錄過程中完成的?？紤]到這些因素，單細胞研究主要側重于 RNA 檢測和分析方法，以獲得與之相關的信息。

單細胞技術的不足之處在于：它們將細胞從其天然細胞環(huán)境中移除。通過消除細胞接觸和相互作用，以及丟失所有空間信息，這些技術都可能改變細胞特性甚至丟失有價值的數(shù)據(jù)參數(shù)。隨著該領域的成熟，這些問題正在得到解決。比如：體內轉錄組分析 (TIVA) 能夠規(guī)避這個問題。TIVA 采用與細胞穿透肽相連的可光活化雙鏈寡核苷酸。該系統(tǒng)被稱為“TIVA 標簽”，它穿過細胞膜，然后失去其肽，從而將其鎖定在細胞內。激光照射揭示了在指定細胞中捕獲 mRNA 的序列。然后分離和擴增細胞 RNA，以量化整個細胞或特定選擇的子隔室的基因表達 。這項技術與完整組織中的神經(jīng)元細胞相比，分離的神經(jīng)元細胞的轉錄本數(shù)量相對增加。這也證實了關于細胞間相互作用的相關理論內容。

基于液滴的單細胞測序數(shù)據(jù)的另一個主要問題是細胞雙聯(lián)體的存在。干細胞是單細胞遺傳分析的重點領域。識別基因圖譜的關鍵差異對發(fā)育生物學和再生醫(yī)學具有潛在的革命性影響。近期的研究表明具有不同遺傳輸出的干細胞的異質性。此外，已經(jīng)實驗表明基因表達的差異不會自動預測表型表達的差異。在整個發(fā)育過程中正在收集有關細胞命運的信息。

單細胞測序技術在蛋白組學上的應用

蛋白質組學研究也在單細胞水平上進行，以確定細胞的功能差異，并幫助確定擴大遺傳探索的關鍵要素。比如：使用質譜法和納米孔技術比較容易實現(xiàn)高通量蛋白質組學篩選，其方法為：將細胞分散在載玻片上，細胞核被染色。然后，熒光鏡識別每個細胞的位置，并將坐標傳遞給激光器進行質譜分析。特定基因在單細胞中的表達也可以通過單細胞蛋白質印跡來檢測，例如，使用來自 ProteinSimple 的 Milo 單細胞蛋白質印跡來估計表達突觸蛋白的腸內分泌細胞（神經(jīng)足類）的百分比。

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