細(xì)胞轉(zhuǎn)染法中的化學(xué)轉(zhuǎn)染法主要三種，即：磷酸鈣法、陽離子脂質(zhì)體法、DEAE- 右旋糖苷法。其中Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3 000 、Lipofectamine 6000等作為陽離子 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法常用的轉(zhuǎn)染試劑 在做轉(zhuǎn)染實驗時幾乎都用過，但是對于Lip2000 轉(zhuǎn)染試劑，你了解多少？這三種轉(zhuǎn)染試劑有什么區(qū)別？

一、Lip 2000轉(zhuǎn)染試劑的特征

Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑主要有以下幾個特點：

1. 操作過程簡單：使用lip轉(zhuǎn)染試劑進行DNA轉(zhuǎn)染時，可以直接將DNA與陽離子脂質(zhì)體混合和加入培養(yǎng)基中，而且不論是瞬時轉(zhuǎn)染還是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染都能用。在轉(zhuǎn)染時不需要清除血清。

2. Lip轉(zhuǎn)染試劑的適用性較為廣，并且轉(zhuǎn)染效率較高，重復(fù)性較好，比如：升級后的lip3000可以重復(fù)轉(zhuǎn)染。如果使用DEAE-右旋糖苷法進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，雖然操作步驟相對簡便、結(jié)果也能實現(xiàn)可重復(fù)，但該轉(zhuǎn)染法對細(xì)胞的毒副作用較大，也只能用在瞬時轉(zhuǎn)染中，并且在轉(zhuǎn)染過程中還需要去除血清。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染效果一般會隨細(xì)胞類型的不同而出現(xiàn)不同程度的差異。

二、Lip2000轉(zhuǎn)染步驟

1.轉(zhuǎn)染前24小時，可以用40*50*10⁴ 細(xì)胞/孔進行細(xì)胞鋪板。

2.轉(zhuǎn)染前1小時左右更換新鮮的培養(yǎng)基。在離心管中加入質(zhì)粒DNA4ug和250uL的DMEM溶液中混合均勻，并在室溫下放置5分鐘左右。

3.取無菌的離心管加入250UL的DMEM培養(yǎng)基，再加入5-10UL的LIP2000轉(zhuǎn)染試劑混勻后，室溫放置5分鐘。注意放置時間不宜過長，以免降低細(xì)胞的活性。

4.將混合稀釋后的DNA與混合稀釋后的Lip2000，混合均勻置于室溫中孵育20min。混合過程中有可能溶液會變渾濁，不過一般不會影響到轉(zhuǎn)染效率。

5.將孵育后的復(fù)合物均勻地加入到培養(yǎng)板中，輕輕托起并搖勻。在37℃，5%的二氧化碳培養(yǎng)環(huán)境中再次孵育6-12小時，更換新鮮的培養(yǎng)基。

6.瞬時轉(zhuǎn)染：接著上述步驟再培養(yǎng)24-48小時后，即可使用細(xì)胞顯微成像系統(tǒng)對細(xì)胞進行細(xì)胞活性檢測，分析轉(zhuǎn)染結(jié)果。

7.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：如果是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染則需要在孵育24H后，加入抗生素類試劑進行穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選，這樣的穩(wěn)定表達過程一般需要數(shù)天或幾周的時間。

三、Lip2000轉(zhuǎn)染試劑的適用范圍：

Lip 2000的使用范圍較廣，它不僅可以用于質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染、siRNA表達載體、 雙鏈核糖核酸dsRNA轉(zhuǎn)染, 以及RNA等核酸轉(zhuǎn)染，還可以用于文庫篩選的高通量轉(zhuǎn)染。對于細(xì)胞轉(zhuǎn)染Lip 2000幾乎涵蓋了HEK293、CHO細(xì)胞等190多種細(xì)胞系。

四、Lip2000轉(zhuǎn)染試劑的用量及注意事項：

按照LIP2000說明書，正常情況下使用24孔板進行轉(zhuǎn)染實驗，使用量為2ul/次，也就是說一支1.5ml Lip 2000大該可以使用將近700余次。

在使用LIP2000時還需要注意一下幾點：

1. 由于LIP2000對細(xì)胞的毒性較弱，但仍具有細(xì)胞毒性，所以進行細(xì)胞鋪板時，細(xì)胞的普板密度需要達到90%以上，這樣可以減少轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞毒性造成的細(xì)胞損耗。當(dāng)然，如果要保證細(xì)胞成活率，條件允許可以使用LIP3000或lip6000的無細(xì)胞毒性的試劑進行轉(zhuǎn)染。

2.在進行DNA轉(zhuǎn)染過程為獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，可以進行轉(zhuǎn)染優(yōu)化實驗，在優(yōu)化實驗中，可以通過調(diào)整DNA濃度和轉(zhuǎn)染試劑量來測試實現(xiàn)。  

3.LIP2000陽離子脂質(zhì)體的保存溫度為4度冷藏保存，切勿冷凍保存。過低的溫度容易破壞脂質(zhì)體內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而造成轉(zhuǎn)染效率低，甚至無法轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染失敗等現(xiàn)象。儲存過程中也盡量避免長時間開蓋，以避免脂質(zhì)體氧化對轉(zhuǎn)染效率的影響。

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