hTERT成纖維細(xì)胞為永生化子宮內(nèi)膜成纖維細(xì)胞 (T HESC) 具有延長的壽命，并且在核型、形態(tài)和表型方面與原代親代細(xì)胞相似。在功能上，T HESCs 顯示激素治療后蛻膜化的生化終點(diǎn)。

  THESCs 來源于從患有肌瘤的成年女性身上獲得的基質(zhì)細(xì)胞。原代基質(zhì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞通過用來自包裝細(xì)胞系 pA317-hTERT 的上清液感染而永生化，該細(xì)胞系表達(dá) hTERT 和嘌呤霉素抗性基因。

hTERT成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方案如下：

一、所需材料

Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基 (DMEM)/F12 (Sigma, D2906)

碳酸氫鈉

ITS+ Universal Culture Supplement Premix (BD, 354352)

嘌呤霉素

木炭/葡聚糖處理的胎牛血清（Hyclone，SH30068.03）

胰蛋白酶-EDTA 溶液（HBSS 中的 0.25% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA）

細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試的 DMSO 

實(shí)驗(yàn)耗材：T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶、T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶、nest錐形瓶、移液槍吸頭等

實(shí)驗(yàn)室儀器：-80冰箱、知楚二氧化碳振蕩搖床、恒溫水浴鍋、瑞寧移液器、液氮罐、倒置顯微鏡等

二、完全培養(yǎng)基的制備

這些細(xì)胞系的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是 DMEM/F12，輔以：

1.5 克/升碳酸氫鈉

1% ITS+ Universal Culture Supplement Premix

500 納克/毫升嘌呤霉素

10% 木炭/葡聚糖處理的胎牛血清

三、冷凍細(xì)胞的處理程序和培養(yǎng)的啟動(dòng)

為確保高活力，解凍小瓶并在收到后盡快開始培養(yǎng)。如果到達(dá)后需要儲(chǔ)存冷凍培養(yǎng)物，請(qǐng)將小瓶?jī)?chǔ)存在液氮蒸氣中，而不是-70°C。在 -70°C 下儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致活性喪失。

有關(guān)從每批 ATCC 子宮內(nèi)膜成纖維細(xì)胞中回收的活細(xì)胞總數(shù)，請(qǐng)參閱產(chǎn)品信息表最后一頁上提供的批次特定信息。

準(zhǔn)備一個(gè)含有推薦的完全培養(yǎng)基的 25 cm2 或 75 cm2 培養(yǎng)瓶。在添加小瓶?jī)?nèi)容物之前，應(yīng)將含有生長培養(yǎng)基的容器置于培養(yǎng)箱中至少 15 分鐘，以使培養(yǎng)基達(dá)到其正常 pH 值（7.0 至 7.6），并避免在恢復(fù)過程中培養(yǎng)基堿度過高的細(xì)胞。

在 37°C 水浴中輕輕攪拌解凍小瓶。為減少污染的可能性，請(qǐng)將 O 形圈和蓋子遠(yuǎn)離水。解凍應(yīng)該很快（大約 2 分鐘）。

1.細(xì)胞解凍后，請(qǐng)盡快從水浴鍋中取出，并使用 70% 乙醇溶液來進(jìn)行凈化。操作過程需要在無菌環(huán)境中進(jìn)行，避免污染。

2.將小瓶?jī)?nèi)容物轉(zhuǎn)移到含有 6.0 至 8.0 mL 完全培養(yǎng)基的離心管中，并以大約 125 xg 的速度將細(xì)胞懸浮液離心 5 至 7 分鐘。

3.丟棄上清液并將細(xì)胞重新懸浮在新鮮的生長培養(yǎng)基中（有關(guān)推薦的稀釋比，請(qǐng)參閱特定于批次的信息）。將此懸浮液添加到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)容器中。

4.在 37°C、5% CO 2加濕培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)物。

四、繼代培養(yǎng)程序

使用nest的T75錐形瓶進(jìn)行培養(yǎng)的體積。增加或減少其他尺寸的培養(yǎng)容器所需的解離介質(zhì)的量。

hTERT成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)注意事項(xiàng)：
為避免結(jié)塊，在等待細(xì)胞分離時(shí)不要敲打或搖動(dòng)燒瓶。難以分離的細(xì)胞可置于 37°C 以促進(jìn)分散。細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要每 2 到 3 天更新一次培養(yǎng)基。

1.有關(guān)細(xì)胞傳代培養(yǎng)的濃度，請(qǐng)參閱產(chǎn)品信息表。當(dāng)確定細(xì)胞已準(zhǔn)備好進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，繼續(xù)下一步。

2.取出并丟棄介質(zhì)。

3.向燒瓶中加入 2.0 至 3.0 mL Trypsin-EDTA 溶液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，直至細(xì)胞層分散（通常在 5 至 15 分鐘內(nèi)）。

4.添加 6.0 至 8.0 mL 的完全生長培養(yǎng)基，并通過輕輕移液吸出細(xì)胞。

5.將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到 15 mL 離心管中，并以大約 125 xg 的速度旋轉(zhuǎn) 5 至 10 分鐘。

6.丟棄上清液并在新鮮生長培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。將適當(dāng)?shù)募?xì)胞懸浮液等分試樣添加到新的細(xì)胞搖瓶中。
7.有關(guān)推薦的接種濃度，請(qǐng)參閱產(chǎn)品表。

五、細(xì)胞凍存

在以下培養(yǎng)基中冷凍細(xì)胞：95% 完全生長培養(yǎng)基，5% DMSO。將小瓶?jī)?chǔ)存在液氮蒸氣中。避免將小瓶浸入液氮中。

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