標(biāo)簽：基因組  dna提取 科學(xué)  科普

在分子生物實(shí)驗(yàn)中我們通常會(huì)提取基因組DNA和質(zhì)粒DNA，不知道大家有沒(méi)有注意到，同樣是DNA提取 ，但提取方法確實(shí)截然不同的。比如：要分離質(zhì)粒 DNA，就需要打開(kāi)細(xì)胞并進(jìn)行小量制備，盡量避免污染基因組DNA 。而對(duì)于基因組DNA，只需要用不同的方式來(lái)打開(kāi)細(xì)胞并嘗試分離出盡可能多的內(nèi)容物就可以了 。

一、基因組DNA提?。?/span>

1. 細(xì)胞裂解

基因組 DNA (gDNA) 的提取 程序較為簡(jiǎn)單，是用強(qiáng)裂解液裂解細(xì)胞將 gDNA 釋放到溶液即可。對(duì)于酵母、植物和細(xì)菌等具有堅(jiān)固細(xì)胞壁的樣本需要 通過(guò)酶促反應(yīng)和機(jī)械破壁等方法破壞細(xì)胞壁后，再進(jìn)行DNA提取。細(xì)胞壁通常容易被溶菌酶消化，溶菌酶可水解細(xì)胞壁肽聚糖和絲氨酸蛋白酶 K。所以對(duì)于某些革蘭氏陽(yáng)性菌，溶葡萄球菌素將進(jìn)一步幫助酶消化。當(dāng)然對(duì)于不同細(xì)胞壁成分的生物樣本 ，需要使用不同的酶。

機(jī)械破壁中，高速珠磨法是通用的 gDNA 提取裂解方法。實(shí)驗(yàn)中使用 0.1 毫米玻璃珠或 0.15 毫米細(xì)磁珠在渦旋振蕩器上就可以 輕松完成此操作。對(duì)于堅(jiān)韌的絲狀真菌（例如曲霉屬和鐮刀菌屬），細(xì)胞材料可以在液氮中速凍，并在研杵和研缽中研磨，然后在含適當(dāng)裂解緩沖液的溶液中快速渦旋攪拌即可完成破壁操作 。

2.DNA純化

細(xì)胞裂解（將 gDNA 帶入溶液）后，接下來(lái)要做的就是純化樣品。普通實(shí)驗(yàn)中是一般使用苯酚- 氯仿或旋轉(zhuǎn)過(guò)濾膜技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，也可以使用DNA純化相關(guān)試劑盒。

3.基因組DNA提取時(shí)的注意事項(xiàng)

染色體在純化過(guò)程中會(huì)斷裂，這對(duì)于 PCR 和 qPCR實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，斷裂實(shí)際上可能是有利的，因?yàn)樗兄?DNA 熔解，從而導(dǎo)致更有效的擴(kuò)增反應(yīng)。然而，對(duì)于長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序和 長(zhǎng)距離測(cè)序）使用，這樣的DNA片段將不適用。如果確實(shí)需要分離較長(zhǎng) DNA 片段，則應(yīng)該考慮另外的細(xì)胞裂解方式。

二、質(zhì)粒DNA提取

質(zhì)粒 DNA 提取有點(diǎn)棘手，因?yàn)橘|(zhì)粒 DNA 必須與 gDNA 分開(kāi)。這種分離基于DNA片段的大小，而良好的分離依賴于使用正確的裂解方法。

1. 堿裂解

對(duì)于質(zhì)粒 DNA 提取，細(xì)胞裂解需要考慮的因素也較多。Birnboim 和 Doly于 1979 年發(fā)明了通用的堿裂解 提取質(zhì)粒 DNA 的方法。

裂這種裂解法里的裂解緩沖液中含有氫氧化鈉和 SDS，可較完全地變性 質(zhì)粒和 gDNA（即將 DNA 分離成單鏈）。需要注意的是此步驟必須快速執(zhí)行，因?yàn)檫^(guò)度變性可能會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒不可逆地變性。

接下來(lái)，樣品在醋酸鉀溶液中被中和以復(fù)性質(zhì)粒。這是分離質(zhì)粒和 gDNA 的關(guān)鍵。由于質(zhì)粒很小，它們很容易重新退火形成 dsDNA。然而，基因組 DNA 太長(zhǎng)而無(wú)法完全重新退火，相反它往往會(huì)纏結(jié)，因此互補(bǔ)鏈保持分離。

在離心過(guò)程中，gDNA（與蛋白質(zhì)結(jié)合）形成沉淀，而質(zhì)粒 DNA 保持可溶。這一步的關(guān)鍵是不要?jiǎng)×覝u旋或混合樣品，因?yàn)?gDNA 很容易斷裂，而且斷裂的 gDNA 可能小到足以重新退火并與質(zhì)粒一起進(jìn)入溶液中。

2. DNA純化

該步驟可以使用苯酚-氯仿或旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器對(duì)上清液中的質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行乙醇沉淀或凈化。如果您使用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾技術(shù)，中和緩沖液將包含胍鹽，因此裂解物可以直接結(jié)合硅膠進(jìn)行進(jìn)一步洗滌和洗脫。所得 DNA 純度足以滿足大多數(shù)下游分子生物學(xué)應(yīng)用的需求。如果需要質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，則可以選擇陰離子交換純化來(lái)去除污染內(nèi)毒素。當(dāng)然使用硅膠純化裝置也是可以去除內(nèi)毒素的 。該純化方法適用于哺乳動(dòng)物和其他真核質(zhì)粒以及其他小的染色體外 DNA 種類。但需要注意，哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物核外細(xì)胞器中的 質(zhì)粒拷貝數(shù)通常要低得多。

3. 質(zhì)粒DNA提取的注意事項(xiàng)

質(zhì)粒 DNA 通常為 3-5 kb，具體取決于插入片段的大小。存在的特定 復(fù)制起點(diǎn)將影響每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)。典型的高拷貝質(zhì)粒，如 pUC 或 pBluescript ，每毫升培養(yǎng)物應(yīng)產(chǎn)生 4-5 μg DNA。要分離高產(chǎn)量的質(zhì)粒 DNA，請(qǐng)使用對(duì)數(shù)后期或穩(wěn)定早期的培養(yǎng)物。還需要注意使用新鮮的單菌落和新鮮的選擇抗生素以正確的濃度制備培養(yǎng)物以維持質(zhì)粒。重要的是過(guò)度生長(zhǎng)細(xì)菌培養(yǎng)物，可能會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒提取物中的 gDNA 污染。

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