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蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司

16年專注生物實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備&耗材綜合供應(yīng)

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阿爾法構(gòu)建全服務(wù)鏈體系 尊享高于原廠服務(wù)的價(jià)值
昆蟲細(xì)胞質(zhì)粒DNA提取和酶切的完整實(shí)驗(yàn)步驟
作者: 編輯: 來(lái)源: 發(fā)布日期: 2023.09.14
信息摘要:
昆蟲細(xì)胞質(zhì)粒DNA提取和酶切是一種常用的實(shí)驗(yàn)方法,用于研究昆蟲基因組和基因功能。昆蟲細(xì)胞通過(guò)裂解,釋放DNA。接著,使用DNA提取試劑盒提取…

昆蟲細(xì)胞質(zhì)粒DNA提取和酶切是一種常用的實(shí)驗(yàn)方法,用于研究昆蟲基因組和基因功能。昆蟲細(xì)胞需要被裂解,釋放DNA。接著,使用DNA提取試劑盒提取DNA,純化得到目標(biāo)DNA。然后,通過(guò)酶切反應(yīng)使用限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行切割。這些步驟將可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn),如PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序,以研究昆蟲基因的結(jié)構(gòu)和功能。

一、昆蟲細(xì)胞質(zhì)粒DNA提取

實(shí)驗(yàn)材料:

- 1.5ml細(xì)菌培養(yǎng)物

- 100 μl溶液I50 mmol/L葡萄糖,10 mmol/L EDTA pH 8.0,25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0

- 200 μl溶液II0.2 mol/L NaOH,1SDS

- 150 μl溶液III60 ml 5 mol/L乙酸鉀,11.5 ml 冰乙酸,28.5 ml H2O

- 70%乙醇

- ddH2O

- 0.5μl RNase

-質(zhì)粒提取試劑盒

步驟:

1. 1.5ml細(xì)菌培養(yǎng)物,4000rpm離心1分鐘,棄上清液,使細(xì)菌沉淀盡量干燥。

2. 將細(xì)菌沉淀重懸于用冰預(yù)冷的100 μl溶液I中,劇烈振蕩。

3. 加入200 μl溶液II,蓋緊管口,快速顛倒離心管5次,使溶液II與細(xì)菌完全混合,置于冰浴中。

4. 加入150 μl溶液III,蓋緊管口,反復(fù)顛倒數(shù)次,使溶液III在細(xì)菌裂解物中均勻分散,置于冰上3-5分鐘。

5. 在最大轉(zhuǎn)速下離心5分鐘,取上清液于另一個(gè)新的管中。

6. 用兩倍體積的乙醇沉淀DNA,振蕩混合,室溫放置2分鐘,最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘。

7. 小心吸去上清液,倒置于濾紙上,使所有液體都流出。

8. 加入1ml 70%乙醇洗滌沉淀,振蕩混合,用12000g離心2分鐘,棄上清液,放置于室溫使乙醇揮發(fā),直至EP管內(nèi)沒(méi)有可見液體存在(5-10分鐘)。

9. 0.5μlRNase37℃溫育5-10分鐘。

10. 使用電泳儀設(shè)備進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定。

二、昆蟲細(xì)胞質(zhì)粒DNA酶切

實(shí)驗(yàn)材料:

- 待切樣品DNA

- 10×緩沖液

- 限制性內(nèi)切酶

- ddH2O

步驟:

1. 酶切前確定待切樣品的濃度,并選擇合適的限制性內(nèi)切酶和配套緩沖液。

2. 在離心管中加入如下成分:10×緩沖液1μl、待切樣品xμl、酶0.5-1μl,加水補(bǔ)足10μl。

3. 混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底。

4. 將離心管置于37℃中溫育1-3小時(shí),若待切樣品為PCR產(chǎn)物,則可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。

5. 用未酶切的質(zhì)粒作為對(duì)照,進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果。

三、昆蟲細(xì)胞質(zhì)粒DNA連接

實(shí)驗(yàn)材料:

- 待連接的樣品(膠回收產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物,載體與片段的mol比為13-5

- 10×連接緩沖液

- T4連接酶

- ddH2O

步驟:

1. 連接前先使用電泳儀確定待連接載體與片段的濃度。

2. 在離心管中加入如下成分:10×連接緩沖液1μl、待連接的樣品xμl、連接酶0.5-1μl,加水補(bǔ)足10μl。

3. 混勻樣品并短暫離心使樣品全部沉于管底。

4. 將離心管置于連接酶要求的溫度孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(根據(jù)不同公司的酶的要求而定,一般為221-3小時(shí)或16℃連接過(guò)夜)。

5. 連接完的樣品可直接用于轉(zhuǎn)化,也可放于4℃冰箱短期保存。

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)步驟,可以實(shí)現(xiàn)昆蟲細(xì)胞質(zhì)粒DNA的提取、酶切和連接,為后續(xù)的PCR擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)

四、PCR擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)材料:

- 連接完的樣品

- PCR反應(yīng)體系所需試劑(Taq聚合酶、引物、反應(yīng)緩沖液等)

- ddH2O

-PCR儀

步驟:

1. 準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定反應(yīng)體系組份和體積,同時(shí)設(shè)計(jì)合適的引物。

2. PCR反應(yīng)管中加入反應(yīng)體系所需試劑,如Taq聚合酶、引物和反應(yīng)緩沖液等。

3. 加入連接完的樣品,注意控制反應(yīng)體系中DNA的濃度。

4. 加入適量的ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)體系總體積。

5. 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),根據(jù)引物設(shè)計(jì)的溫度條件選擇合適的PCR程序。

6. 擴(kuò)增結(jié)束后,取10μl反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析,確認(rèn)PCR擴(kuò)增結(jié)果。

五、DNA回收與純化

實(shí)驗(yàn)材料:

- PCR反應(yīng)產(chǎn)物

- 天根DNA回收試劑盒(如PCR純化試劑盒)

步驟:

1. 準(zhǔn)備天根DNA回收試劑盒,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書中的步驟進(jìn)行操作。

2. PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入DNA回收試劑盒提供的柱子或管子中,進(jìn)行離心分離。

3. 緊接著,根據(jù)試劑盒的要求,采用洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌步驟,去除雜質(zhì)。

4. 使用洗滌緩沖液洗滌后,將柱子或管子中的DNA進(jìn)行洗脫,得到純化后的DNA樣品。

5. 使用瓊脂糖電泳儀鑒定純化后的DNA樣品的質(zhì)量和濃度。

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)步驟,你可以將昆蟲細(xì)胞質(zhì)粒DNA經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增,然后進(jìn)行DNA回收與純化,得到純凈的DNA樣品,用于后續(xù)的分析、測(cè)序等實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)總結(jié):

這個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟詳細(xì)介紹了昆蟲細(xì)胞質(zhì)粒DNA的提取、酶切、連接、PCR擴(kuò)增以及DNA回收與純化的過(guò)程。這些步驟需要仔細(xì)操作,以確保提取的DNA質(zhì)量和純度。此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取,提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切和PCR擴(kuò)增。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,注意控制反應(yīng)條件,如時(shí)間、溫度和試劑濃度,以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。然后使用天能瓊脂糖電泳進(jìn)行分析,以確認(rèn)提取的DNA的質(zhì)量和濃度。

 蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司是一家專注于提供實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、實(shí)驗(yàn)耗材和實(shí)驗(yàn)試劑的綜合性公司。我們引領(lǐng)著實(shí)驗(yàn)器材行業(yè)的發(fā)展,為科研人員提供高質(zhì)量、高效率的實(shí)驗(yàn)室解決方案。

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   此外,我們還提供天根核酸提取試劑盒、PCR Taq酶以及各種酶等生物試劑。我們的產(chǎn)品經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制,確保了其在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的穩(wěn)定性和可靠性。碧云天生化試劑和Biosharp生化試劑則是我們配套的實(shí)驗(yàn)試劑,可滿足您在生物研究過(guò)程中的各種需求。

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 除了耗材外,我們還提供國(guó)產(chǎn)CHO細(xì)胞、HEK細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞株等細(xì)胞產(chǎn)品服務(wù),致力于為生物領(lǐng)域的科學(xué)家提供全方位的支持和解決方案。 



蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司成立于2008年,位于蘇州園區(qū)生物納米園(Biobay)A5幢301室。公司管理團(tuán)隊(duì)專注于科學(xué)儀器行業(yè)十四年,擁有專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)與完善的售后服務(wù)體系,目前已為300余家實(shí)驗(yàn)室提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù),涵蓋各大高校、檢測(cè)中心、科研機(jī)構(gòu)、制藥企業(yè)等13個(gè)群體。提供的實(shí)驗(yàn)室儀器主要包括振蕩培養(yǎng)箱,恒溫恒濕培養(yǎng)箱、二氧化碳培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、PCR儀,瑞寧移液器,生物反應(yīng)器,發(fā)酵罐,超低溫冰箱,液氮罐,高壓滅菌器,超純水機(jī),天平,離心機(jī),離心濃縮儀、研磨機(jī)、葡萄糖乳酸分析儀等。廠商企業(yè)授權(quán)包括知楚儀器、朗基、中科美菱,梅特勒,樂(lè)楓,搏旅、NEST、天根、奧盛在內(nèi)的80個(gè)余廠家。

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