昆蟲細(xì)胞質(zhì)粒DNA提取和酶切是一種常用的實(shí)驗(yàn)方法,用于研究昆蟲基因組和基因功能。昆蟲細(xì)胞需要被裂解,釋放DNA。接著,使用DNA提取試劑盒提取DNA,純化得到目標(biāo)DNA。然后,通過(guò)酶切反應(yīng)使用限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行切割。這些步驟將可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn),如PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序,以研究昆蟲基因的結(jié)構(gòu)和功能。
一、昆蟲細(xì)胞質(zhì)粒DNA提取
實(shí)驗(yàn)材料:
- 1.5ml細(xì)菌培養(yǎng)物
- 100 μl溶液I(50 mmol/L葡萄糖,10 mmol/L EDTA pH 8.0,25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)
- 200 μl溶液II(0.2 mol/L NaOH,1%SDS)
- 150 μl溶液III(60 ml 5 mol/L乙酸鉀,11.5 ml 冰乙酸,28.5 ml H2O)
- 70%乙醇
- ddH2O
- 0.5μl RNase
-質(zhì)粒提取試劑盒
步驟:
1. 取1.5ml細(xì)菌培養(yǎng)物,4000rpm離心1分鐘,棄上清液,使細(xì)菌沉淀盡量干燥。
2. 將細(xì)菌沉淀重懸于用冰預(yù)冷的100 μl溶液I中,劇烈振蕩。
3. 加入200 μl溶液II,蓋緊管口,快速顛倒離心管5次,使溶液II與細(xì)菌完全混合,置于冰浴中。
4. 加入150 μl溶液III,蓋緊管口,反復(fù)顛倒數(shù)次,使溶液III在細(xì)菌裂解物中均勻分散,置于冰上3-5分鐘。
5. 在最大轉(zhuǎn)速下離心5分鐘,取上清液于另一個(gè)新的管中。
6. 用兩倍體積的乙醇沉淀DNA,振蕩混合,室溫放置2分鐘,最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘。
7. 小心吸去上清液,倒置于濾紙上,使所有液體都流出。
8. 加入1ml 70%乙醇洗滌沉淀,振蕩混合,用12000g離心2分鐘,棄上清液,放置于室溫使乙醇揮發(fā),直至EP管內(nèi)沒(méi)有可見液體存在(5-10分鐘)。
9. 用0.5μl的RNase在37℃溫育5-10分鐘。
10. 使用電泳儀設(shè)備進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定。
二、昆蟲細(xì)胞質(zhì)粒DNA酶切
實(shí)驗(yàn)材料:
- 待切樣品DNA
- 10×緩沖液
- 限制性內(nèi)切酶
- ddH2O
步驟:
1. 酶切前確定待切樣品的濃度,并選擇合適的限制性內(nèi)切酶和配套緩沖液。
2. 在離心管中加入如下成分:10×緩沖液1μl、待切樣品xμl、酶0.5-1μl,加水補(bǔ)足10μl。
3. 混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底。
4. 將離心管置于37℃中溫育1-3小時(shí),若待切樣品為PCR產(chǎn)物,則可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。
5. 用未酶切的質(zhì)粒作為對(duì)照,進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果。
三、昆蟲細(xì)胞質(zhì)粒DNA連接
實(shí)驗(yàn)材料:
- 待連接的樣品(膠回收產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物,載體與片段的mol比為1∶3-5)
- 10×連接緩沖液
- T4連接酶
- ddH2O
步驟:
1. 連接前先使用電泳儀確定待連接載體與片段的濃度。
2. 在離心管中加入如下成分:10×連接緩沖液1μl、待連接的樣品xμl、連接酶0.5-1μl,加水補(bǔ)足10μl。
3. 混勻樣品并短暫離心使樣品全部沉于管底。
4. 將離心管置于連接酶要求的溫度孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(根據(jù)不同公司的酶的要求而定,一般為22℃1-3小時(shí)或16℃連接過(guò)夜)。
5. 連接完的樣品可直接用于轉(zhuǎn)化,也可放于4℃冰箱短期保存。
通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)步驟,可以實(shí)現(xiàn)昆蟲細(xì)胞質(zhì)粒DNA的提取、酶切和連接,為后續(xù)的PCR擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)。
四、PCR擴(kuò)增
實(shí)驗(yàn)材料:
- 連接完的樣品
- PCR反應(yīng)體系所需試劑(Taq聚合酶、引物、反應(yīng)緩沖液等)
- ddH2O
-PCR儀
步驟:
1. 準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定反應(yīng)體系組份和體積,同時(shí)設(shè)計(jì)合適的引物。
2. 在PCR反應(yīng)管中加入反應(yīng)體系所需試劑,如Taq聚合酶、引物和反應(yīng)緩沖液等。
3. 加入連接完的樣品,注意控制反應(yīng)體系中DNA的濃度。
4. 加入適量的ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)體系總體積。
5. 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),根據(jù)引物設(shè)計(jì)的溫度條件選擇合適的PCR程序。
6. 擴(kuò)增結(jié)束后,取10μl反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析,確認(rèn)PCR擴(kuò)增結(jié)果。
五、DNA回收與純化
實(shí)驗(yàn)材料:
- PCR反應(yīng)產(chǎn)物
- 天根DNA回收試劑盒(如PCR純化試劑盒)
步驟:
1. 準(zhǔn)備天根DNA回收試劑盒,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書中的步驟進(jìn)行操作。
2. 將PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入DNA回收試劑盒提供的柱子或管子中,進(jìn)行離心分離。
3. 緊接著,根據(jù)試劑盒的要求,采用洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌步驟,去除雜質(zhì)。
4. 使用洗滌緩沖液洗滌后,將柱子或管子中的DNA進(jìn)行洗脫,得到純化后的DNA樣品。
5. 使用瓊脂糖電泳儀鑒定純化后的DNA樣品的質(zhì)量和濃度。
通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)步驟,你可以將昆蟲細(xì)胞質(zhì)粒DNA經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增,然后進(jìn)行DNA回收與純化,得到純凈的DNA樣品,用于后續(xù)的分析、測(cè)序等實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)總結(jié):
這個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟詳細(xì)介紹了昆蟲細(xì)胞質(zhì)粒DNA的提取、酶切、連接、PCR擴(kuò)增以及DNA回收與純化的過(guò)程。這些步驟需要仔細(xì)操作,以確保提取的DNA質(zhì)量和純度。此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取,提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切和PCR擴(kuò)增。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,注意控制反應(yīng)條件,如時(shí)間、溫度和試劑濃度,以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。然后使用天能瓊脂糖電泳進(jìn)行分析,以確認(rèn)提取的DNA的質(zhì)量和濃度。
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