隨著生物反應(yīng)器的普遍使用及發(fā)展，使用生物反應(yīng)器生產(chǎn)細(xì)胞和再生組織，已成為生物醫(yī)學(xué)工程研究的主流。CM領(lǐng)域作為新興研究領(lǐng)域開始實(shí)踐將工程組織將轉(zhuǎn)化為可行的食品。利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)人造肉的流程是什么樣的？將會面臨哪些需要解決的問題呢？

一、組織工程人造肉生產(chǎn)與養(yǎng)殖肉類的區(qū)別

養(yǎng)殖肉類和生物醫(yī)學(xué)組織工程之間的主要差異主要表現(xiàn)在：成本、規(guī)模、口感、可接受程度等。其中組織工程中影響較大的對生物支架的材料的選擇方面。 制造 CM 的一個關(guān)鍵考慮因素是制造方法。在自上而下的方法中，預(yù)制支架上裝有細(xì)胞，然后灌注以允許細(xì)胞遷移和 ECM 形成。在自下而上的方法中，較小的模塊化單元（例如載有細(xì)胞的片材、管、球體、類器官或其他微結(jié)構(gòu)）可以用作組裝的構(gòu)建塊。結(jié)合這些方法也可用于制造復(fù)雜的肉制品。制造方法的選擇將取決于各種參數(shù)，例如產(chǎn)品的類型、產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)、產(chǎn)品的質(zhì)地以及該方法對商業(yè)放大的適用程度。雖然已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模構(gòu)想了許多制造方法，但尚不清楚其中哪些可能最好地轉(zhuǎn)化為工業(yè)。一些對生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用有效的方法可能對 CM 不切實(shí)際，而其他在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域證明不足的方法可能值得重新考慮用于食品生產(chǎn)。

二、利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)人造肉的流程是什么樣的？

     CM的生產(chǎn)過程大致可分為四個主要領(lǐng)域。起初，需要從感興趣的物種中培養(yǎng)出能夠分化為肌肉纖維、脂肪細(xì)胞和少數(shù)其他重要細(xì)胞類型（如成纖維細(xì)胞）的細(xì)胞系。 其次，需要開發(fā)使用低成本、食品安全成分支持高增殖率的培養(yǎng)基配方。再者，至少對于某些生物過程和產(chǎn)品類型，需要開發(fā)模擬 ECM 功能的食品安全支架。而后，必須開發(fā)和擴(kuò)展生物反應(yīng)器和生物工藝，同時牢記與成本、無菌、食品安全以及維持長期細(xì)胞生長和組織的適當(dāng)條件的能力相關(guān)的限制成熟。   雖然生物制藥行業(yè)在高達(dá) 20 000 L 的攪拌罐生物反應(yīng)器中培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞，但仍然需要生物反應(yīng)器設(shè)計方面的重大創(chuàng)新，特別是在支持大規(guī)模生產(chǎn)結(jié)構(gòu)化組織的能力方面。根據(jù)所需的最終產(chǎn)品和選擇的生產(chǎn)工藝，可能需要增加收獲后加工步驟來將細(xì)胞或組織形成最終產(chǎn)品。這些過程可能因產(chǎn)品而異，在許多情況下可能類似于用于加工傳統(tǒng)肉類的方法。

    在實(shí)踐中，不同公司和產(chǎn)品的生產(chǎn)過程細(xì)節(jié)可能會有很大差異，任何生產(chǎn)過程的初始階段都是從感興趣的物種中分離和表征合適的細(xì)胞，并將這些細(xì)胞儲存起來以備將來使用。在許多情況下，這一步將包括開發(fā)穩(wěn)定的永化細(xì)胞系。公司可以自己進(jìn)行細(xì)胞分離和細(xì)胞系開發(fā)步驟或許可使用現(xiàn)有的細(xì)胞系。在第2個階段，細(xì)胞擴(kuò)增以增加總生物量。目標(biāo)是產(chǎn)生大量細(xì)胞倍增，同時保持細(xì)胞處于未分化狀態(tài)，因此處于增殖狀態(tài)。這一過程中，細(xì)胞在攪拌罐生物反應(yīng)器中生長，并且可以在微載體上、作為聚集體或作為單個細(xì)胞生長。

     在第3階段——組織成熟——細(xì)胞在促進(jìn)細(xì)胞分化和成熟的條件下生長，通常但不總是在支架上。培養(yǎng)基和生物反應(yīng)器的選擇在 II 期和 III 期都至關(guān)重要，并且在兩個階段之間可能會有所不同。對于某些產(chǎn)品類型，將工程組織轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)品需要最后的加工步驟。例如，載有成熟肌纖維的支架可能與可食用的微載體結(jié)合，脂肪細(xì)胞在單獨(dú)的 III 期過程中已在其上分化形成漢堡肉餅?；蛘?，可以在相同的支架上區(qū)分多種細(xì)胞類型，然后將其組合形成最終產(chǎn)品，或者可以堆疊無支架片（其中分泌的 ECM 蛋白代替支架）。 

三、用于細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程的生物支架形式及挑戰(zhàn)

   組織工程所使用的生物支架形式主要有以下幾種。即：微載體、多孔支架、水凝膠或纖維支架。

    生物支架中較簡單的是微載體，通常用于大規(guī)模細(xì)胞增殖。對于組織成熟，大多數(shù)支架可分為多孔支架、水凝膠或纖維支架。雖然多孔支架和纖維支架都包含介質(zhì)可以循環(huán)通過的空隙空間，但它們的結(jié)構(gòu)不同，多孔支架具有海綿狀結(jié)構(gòu)，而纖維支架由長而細(xì)的纖維組成。通常，纖維支架是通過靜電紡絲生產(chǎn)的，但適用于組織工程的高度相似的結(jié)構(gòu)也由某些真菌生產(chǎn)。在某些情況下，微載體也屬于其他三類之一，常見的是水凝膠。微載體一般用于生物反應(yīng)器中細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。3D 生物打印等添加劑方法也很常見，并且經(jīng)常使用基于水凝膠的生物墨水。

1. 微載體

    微載體自1967 年出現(xiàn)后，主要用于擴(kuò)大制藥和生命科學(xué)研究行業(yè)的細(xì)胞規(guī)模。這些細(xì)胞類型包括人間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)、胚胎干細(xì)胞 (ESC)、和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC)。微載體主要由聚苯乙烯、交聯(lián)葡聚糖、纖維素、明膠或聚半乳糖醛酸 (PGA) 組成，并涂有膠原蛋白、含有粘附基序的肽或正電荷以促進(jìn)細(xì)胞粘附。它們的直徑通常在 100 到 200 μm 之間。

  原代牛成肌細(xì)胞已經(jīng)實(shí)現(xiàn)在微載體上培養(yǎng)，并能夠進(jìn)行珠對珠的轉(zhuǎn)移。然而，依賴于從載體中去除酶對于擴(kuò)大規(guī)模來說可能成本過高，因?yàn)榕c制藥行業(yè)相比，食品行業(yè)的利潤率要小得多。使用微載體進(jìn)行CM還要考慮的因素是優(yōu)化載體的形狀，以保護(hù)細(xì)胞免受流體的剪切應(yīng)力或充氣生物反應(yīng)器中的氣泡破裂。

    所以微載體技術(shù)雖然可以以較小的空間來大規(guī)模擴(kuò)增哺乳動物細(xì)胞，但它們也可能在引入與細(xì)胞解離和分離成本、微載體本身的成本、細(xì)胞密度相關(guān)的問題索限制。從而對產(chǎn)品的營養(yǎng)和或感官特性的潛在影響。

2. 多孔支架

    孔徑在幾十到幾百微米范圍內(nèi)的支架具有海綿狀結(jié)構(gòu)，可為種子細(xì)胞形成組織和沉積 ECM 提供所需的機(jī)械穩(wěn)定性。對于肌肉組織工程，這些支架應(yīng)概括肌周結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能和組成，考慮到支架仍將是成熟組織的一個組成部分。

常用的支架制造技術(shù)，如顆粒浸出、熔體成型、冷凍干燥和氣體發(fā)泡等經(jīng)常使用合成聚合物，應(yīng)將其替換為可食用的用于 CM。另外，通過快速冷凍明膠和透明質(zhì)酸溶液產(chǎn)生多孔支架之間的孔隙率 >90%，雖然能夠支持豬脂肪干細(xì)胞的附著、增殖和分化，但對 CM 的適用性可能受到成本和規(guī)?？紤]的限制。所以孔徑、孔隙率和支架材料是影響組織發(fā)育和細(xì)胞存活的關(guān)鍵因素。同時，還應(yīng)考慮整合適合培養(yǎng)基灌注的較大孔，以允許在較厚的 CM 塊中有效運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。

3.纖維支架

隨著靜電紡絲和旋轉(zhuǎn)噴射紡絲技術(shù)的出現(xiàn)，特性的納米纖維可稱為CM生物支架的選擇。比如通過旋轉(zhuǎn)噴射紡明膠絲的技術(shù)，使顯微孔隙率保持在 20% ~60% 之間，這樣有足夠的纖維間空間以促進(jìn)氧氣、養(yǎng)分和廢物的運(yùn)輸。這種紡絲技術(shù)可應(yīng)用于多種材料，包括聚乳酸 PLA， PLGA ，PCL、藻酸鹽、醋酸纖維素、GelMA,纖連蛋白, 白蛋白,明膠等。

4.水凝膠

    水凝膠是一種具有大持水能力的親水性聚合物基質(zhì)，其中基質(zhì)通過物理或化學(xué)方式交聯(lián)。大多數(shù)與 CM 相關(guān)的細(xì)胞類型位于 ECM 內(nèi)部，ECM 本身就是一種水凝膠。因此，水凝膠是 CM 組織工程的合理生物材料選擇。水凝膠對組織工程有幾個重要的要求。聚合物基質(zhì)應(yīng)該是細(xì)胞相容的，由對細(xì)胞無毒的生物材料制成。因?yàn)槲⒘繝I養(yǎng)素和信號分子必須能夠到達(dá)整個組織的細(xì)胞，水凝膠的擴(kuò)散動力學(xué)應(yīng)該允許這些分子以支持細(xì)胞所需的濃度和速率穿透水凝膠的整個厚度。擴(kuò)散動力學(xué)取決于水凝膠的交聯(lián)和微孔結(jié)構(gòu)。水凝膠的硬度可以影響細(xì)胞運(yùn)動、增殖和分化。太硬的水凝膠會抑制增殖和遷移，細(xì)胞需要能夠在組織成熟期間重塑水凝膠。水凝膠的生物化學(xué)對細(xì)胞相容性至關(guān)重要。細(xì)胞粘附和蛋白水解位點(diǎn)應(yīng)結(jié)合到水凝膠中，以促進(jìn)細(xì)胞粘附和遷移。

5.另一種可能適用于 CM 的策略是 3D 生物打印，它允許使用具有所需流變特性的生物墨水以定義的模式沉積細(xì)胞。對于 CM 應(yīng)用，生物墨水必須是可食用的或能夠在培養(yǎng)期間完全生物降解成可食用成分。盡管 3D 打印已被證明可用于多種材料，但大多數(shù)與 CM 相關(guān)的生物墨水都是基于水凝膠的。

6.無支架培養(yǎng)法

通過堆疊或其他方法組合多個平面細(xì)胞片也可用于形成 3D 組織。在這種情況下，根本不使用支架或生物墨水材料，細(xì)胞由它們自己分泌的 ECM 保持在一起。

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