PCR標(biāo)準(zhǔn)操作流程詳解

一、概述

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡(jiǎn)稱PCR）是一種在體外合成雙鏈DNA的技術(shù)。其原理模仿了天然DNA的復(fù)制過程，通過特異引物和高特異性酶，確保反應(yīng)的特異性。典型的PCR反應(yīng)包括三個(gè)步驟：變性、退火和延伸，通過多次循環(huán)，最終獲得目標(biāo)DNA片段。

二、試劑準(zhǔn)備

以下為進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的試劑及其終濃度：

三、操作步驟

1. 配置反應(yīng)體系

將以下成分按順序加入0.5ml的離心管中：

l 加入PCR buffer。

l 加入dNTPs。

l 加入Forward primer。

l 加入Reverse primer。

l 加入Template DNA。

l 加入熱啟動(dòng)酶。

l 用ddH2O補(bǔ)至總體積50 ul。

注意：使用熱啟動(dòng)酶時(shí)，可在常溫下操作；非熱啟動(dòng)型酶需在低溫下配置反應(yīng)體系。 

2. 設(shè)置反應(yīng)條件

根據(jù)試劑盒說明書設(shè)置反應(yīng)時(shí)間和溫度，完成擴(kuò)增后進(jìn)行電泳鑒定。

3. 瓊脂糖核酸電泳

①　準(zhǔn)備電泳器具，用蒸餾水洗凈并架好梳子。

② 根據(jù)所需分離的DNA片段大小，制備適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠。

③ 將瓊脂糖和電泳緩沖液（TAE或TBE）加入錐形瓶中，加熱融化后冷卻至40℃左右，混勻并倒入電泳槽。

④　室溫下凝固凝膠，拔出梳子，準(zhǔn)備點(diǎn)樣。

⑤　在電泳槽中加入電泳緩沖液，確保覆蓋凝膠表面。

⑥ 混合5ul樣品、1ul的6xLoding buffer和1ul染料，緩緩注入點(diǎn)樣孔，避免串孔。

⑦ 接通電源（紅正黑負(fù)），設(shè)置電壓40-60V，電泳時(shí)間30-40min，根據(jù)溴酚藍(lán)的位置判斷是否終止電泳。

⑧ 電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，進(jìn)行凝膠成像觀察，并對(duì)比marker確定片段大小。

不同瓊脂糖濃度對(duì)應(yīng)的DNA片段大小如下表：

四、注意事項(xiàng)

引物設(shè)計(jì)

? 引物應(yīng)設(shè)計(jì)在cDNA的保守區(qū)域。

? 引物長(zhǎng)度應(yīng)在15-28bp之間。

? GC含量應(yīng)在40%-60%之間。

? 避免引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，完成后進(jìn)行BLAST驗(yàn)證。

模板DNA

? 模板可以是單鏈或雙鏈DNA。

? 不同來源的模板起始濃度有一定要求。

? 模板提取后應(yīng)注意保存，避免降解。

其他

? 選擇合適的Taq DNA聚合酶。

? 確保四種dNTP濃度相同。

? 操作過程中戴手套，保持環(huán)境干凈，防止污染。

? PCR用水需經(jīng)過高壓滅菌或0.2um濾膜過濾。

五、常用試劑配方

電泳緩沖液

50xTAE（pH8.5）

Tris 242g

EDTA（Na）37.2g

? 加入800ml去離子水，攪拌溶解

? 加入57.1ml乙酸，調(diào)pH至8.5后定容至1L

10xTBE（pH8.3）

Tris 108g

EDTA 7.44g

硼酸55g

? 加入800ml去離子水，攪拌溶解，調(diào)pH至8.3后定容至1L

上樣緩沖液（6xLoding buffer）

0.25%二甲苯青

0.25%溴酚藍(lán)

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