文章標簽:實時熒光定量pcr儀  引物設(shè)計 生物技術(shù) 科學 科普  pcr儀 pcr 定量pcr  pcr實驗室

      PCR 或聚合酶鏈式反應(yīng)是分子生物學中用于創(chuàng)建特定 DNA 片段的多個副本的技術(shù)。這項技術(shù)是由USA生物化學家 Kary Mullis 于 1983 年開發(fā)的。通過PCR儀進行PCR 使產(chǎn)生數(shù)百萬份 DNA 小片段成為可能。所以PCR儀也是分子生物學和生物技術(shù)實驗室常用于見的實驗室設(shè)備。

PCR的原理

PCR 技術(shù)基于 DNA 的酶促復(fù)制。 在 PCR 中，使用引物介導(dǎo)的酶擴增一小段DNA 。DNA 聚合酶合成與模板 DNA 互補的新 DNA 鏈。DNA 聚合酶只能將核苷酸添加到預(yù)先存在的 3'-OH 基團上。因此，需要一個底漆。因此，更多的核苷酸被添加到 DNA 聚合酶的 3'''末端。 

 PCR實驗主要由三部分所組成：

1.DNA 模板– 樣本中單鏈DNA。

2.DNA 聚合酶–使用 Taq 聚合酶。Taq聚合酶屬于熱穩(wěn)定酶，在較高的溫度下不會變性。

3.寡核苷酸引物s - 這些是與單鏈和反鏈的 3' 末端互補的短鏈單鏈 DNA。

4.脫氧核糖核苷酸三磷酸——它們?yōu)榫酆咸峁┠芰浚?DNA 合成的基石。

5.緩沖系統(tǒng)——鎂離子和鉀離子為 DNA 變性和復(fù)性提供了良好的環(huán)境條件。它對于保真度、聚合酶活性和穩(wěn)定性也很重要。

PCR的基本類型

PCR有以下幾種類型：

1.實時熒光定量 PCR

   實時熒光定量 PCR，在熒光檢測系統(tǒng)的幫助下實時檢測 DNA 擴增。熒光報告基因的信號強度與擴增的 DNA 分子數(shù)量成正比。該實驗中所使用的PCR儀器一般是熒光定量PCR儀。比如：朗基的A600 PCR儀。

2.嵌套 PCR

通過嵌套PCR可以提高樣本的敏感性和特異性。由于意外引物結(jié)合位點的擴增，減少了產(chǎn)物的非特異性結(jié)合。

3.多重PCR  使用多通道高通量的PCR儀可以實現(xiàn)同時擴增許多不同的 DNA 序列。也可以用于在單個 PCR 實驗中擴增多個目標。比如朗基的T30系列PCR儀。

4.定量 PCR

定量PCR主要用于通過 DNA 擴增線性來檢測、表征和量化樣品中的已知序列。

PCR基因擴增步驟

PCR PCR基因擴增主要經(jīng)過3個循環(huán)反應(yīng)：

變性

當反應(yīng)混合物加熱至 94℃ 約 0.5 至 2 分鐘時發(fā)生變性。這會破壞兩條 DNA 鏈之間的氫鍵并將其轉(zhuǎn)化為單鏈 DNA。此時，單鏈作為產(chǎn)生新 DNA 鏈的模板。此階段應(yīng)提供較長時間的溫度以確保DNA鏈的解離。

退火

通過PCR儀設(shè)定的程序?qū)⒎磻?yīng)溫度降至54-60℃約20-40秒。在這里，引物與模板 DNA 上的互補序列結(jié)合。引物是長度約為 20 至 30 個堿基的 DNA 或 RNA 的單鏈序列。

引物是 DNA 合成的起點。DNA鏈分開后以相反的方向運行，因此引物設(shè)計一般有兩個，即：正向引物和反向引物。

延伸

在這一步，溫度升高到72-80℃。Taq 聚合酶將堿基添加到引物的 3' 端。

這會在 5' 到 3' 方向上拉長 DNA。DNA聚合酶在適宜的溫度下增加約1000bp/分鐘。

Taq 聚合酶可以耐受較高的溫度。它附著在引物上并將 DNA 堿基添加到單鏈中。從而獲得了雙鏈DNA分子。

這三個步驟一般重復(fù) 20-40 次，即可在短的時間內(nèi)獲得許多目標的 DNA 序列。

PCR技術(shù)的應(yīng)用

PCR技術(shù)主要應(yīng)用于以下領(lǐng)域：

l 藥物

l 遺傳病突變檢測。

l 基因檢測

l 檢測父母的致病基因。

l 法醫(yī)學

l 用作基因指紋識別的工具

l DNA鑒定

l 親子鑒定

l 研究和遺傳學

l 在基因組研究中比較兩種生物的基因組

l 用于任何來源（例如化石）的 DNA 的系統(tǒng)分析

l 基因表達分析

l 基因圖譜構(gòu)建

PCR實驗中常見問題及解決方案

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