人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的培養(yǎng)是一項重要的細胞培養(yǎng)技術(shù)。下面將詳細介紹HUVEC的培養(yǎng)步驟，并分享一些經(jīng)驗。

1. 準備工作：

   a. 15-20cm長的新生兒臍帶放入無菌的PBS溶液中儲存。

   b. 注意臍帶最多貯存24小時在4℃下，室溫下不超過6小時。

2. 洗滌臍帶：

   a. 使用一個鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中，用無菌的PBS溶液沖洗3-5次，直至污血沖洗干凈。

3. 消化臍帶：

   a. 用手術(shù)鉗夾緊臍帶下端，加入15ml的膠原酶（1mg/ml）室溫下消化15-20分鐘，并不時上下?lián)u動臍帶。

4. 收集消化液：

   a. 消化完后，將下端手術(shù)鉗松開，消化液流入一個50ml無菌離心管中，用無菌的PBS溶液沖洗臍帶2-3次。

5. 離心：

   a. 將收集液離心（2000轉(zhuǎn)/分）3分鐘。

6. 轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中：

   a. 倒去上清，加入10ml M199培養(yǎng)基（加入10U/ml的bFGF），用彎管吹散細胞，將所有液體轉(zhuǎn)入一個用明膠包被好的培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)。

   b. 在每個培養(yǎng)瓶中加入3-4ml無菌的1%明膠溶液，搖勻使得明膠溶液完全鋪滿瓶底，放入37℃孵育，最少2小時，用前將明膠溶液倒掉即可。明膠包被有利于細胞貼壁。

7. 培養(yǎng)細胞：

   a. 培養(yǎng)24小時后，倒掉培養(yǎng)基，并用無菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉紅細胞和死細胞，加入10ml新鮮的M199培養(yǎng)基。

8. 換培養(yǎng)基：

   a. 以后每2天換一次培養(yǎng)基（每次換掉2/3的培養(yǎng)基）。

9. 細胞生長：

   a. 一般培養(yǎng)5-7天，細胞可長滿至80-90%單層，這時可以進行傳代。

10. 傳代：

    a. 倒掉培養(yǎng)基，用無菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2-3ml消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化細胞，在顯微鏡下觀察，一旦細胞變圓，即加入2-3倍有血清的DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

    b. 用彎管將細胞吹打下來，并將所消化的細胞轉(zhuǎn)移到一個50ml無菌離心管中，2000轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘。

    c. 倒掉上清，加入10ml新鮮培基，一般一瓶細胞可傳代3-4瓶。以后照此傳代培養(yǎng)。

11. 優(yōu)化培養(yǎng)：

    a. 一般傳代2-3代（培養(yǎng)了20天左右）用于各種實驗效果較好。

以上是人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的培養(yǎng)步驟，希望對你有所幫助。

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