人原代細胞是直接從組織中分離出來的細胞，包括外周血、臍帶血和骨髓。這些細胞因其在生物過程、疾病進展和藥物開發(fā)研究以及包括基于體外細胞的分析或創(chuàng)建異種移植或人源化小鼠模型在內(nèi)的應用中的重要性而日益受到認可。

如果不需要立即使用，新鮮的原代細胞通常會低溫保存（即冷凍），以便在液氮中長期儲存。處理新鮮樣品資源有限的研究人員也可以 購買冷凍的即用型原代細胞，包括單核細胞 (MNC)、純化的免疫細胞或造血干細胞。解凍冷凍細胞時，正確的技術(shù)和處理可確保細胞在下游應用中的活力、恢復和功能。如何解凍冷凍的原代細胞?
一、實驗前準備：

1. 添加了 10% 胎牛血清 (FBS)的 改良培養(yǎng)基（IMDM）

2. DMEM 含 4500 mg/L D-葡萄糖，添加了 10% FBS

3. RPMI 1640 培養(yǎng)基，添加了 10% FBS

4. 含 2% FBS 的磷酸鹽緩沖鹽水（例如含 2% 胎牛血清的磷酸鹽緩沖鹽）

5. 2 mL 血清移液管（例如nest 血清移液器，2 mL）

6. 25 mL 血清移液管（例如nest 血清移液管，25 mL）

7. 50 mL 錐形管（例如 nest離心管，50 mL）

8. DNase I 溶液 (1 mg/mL)（天根試劑）

9. 細胞計數(shù)儀（博大博聚）

10. 臺盼藍（索萊寶）

11. 移液器（瑞寧移液槍，rainin電動助吸器）

12. 移液器吸頭（瑞寧，耐思）

13. 人原代細胞

注意事項：

 在 37°C 水浴鍋中加熱培養(yǎng)基。如果解凍細胞用于下游細胞分離，可以使用含有 2% FBS 的 PBS。

 從儲存中取出冷凍細胞時，重要的是盡量減少暴露于室溫 (15 - 25°C)。如果不直接進行解凍，請將細胞置于干冰或液氮容器中。

二、解凍細胞

注意：建議一次只解凍一個冷凍細胞小瓶，以防止在較高溫度下長時間暴露于 DMSO。

2.可 用 70% 乙醇或異丙醇擦拭細胞瓶的外部。

 3.在生物安全柜中，將蓋子擰四分之一圈以釋放內(nèi)部壓力，然后重新擰緊。

 輕輕旋轉(zhuǎn)小瓶，在 37°C 水浴中快速解凍細胞。當仍有少量冰時，取出小瓶。這大約需要 1 - 2 分鐘。

三、細胞洗滌和計數(shù)

注意：重要的是在以下步驟中快速工作以確保高細胞活力和恢復。

 用 70% 乙醇或異丙醇再次擦拭小瓶的外部。

 在生物安全柜中，使用 2 mL 血清移液器測量細胞懸浮液的總體積。該值在步驟 13 中用于計算提供的單元格總數(shù)。將細胞放回小瓶中以混合懸浮液。

 取出 20 μL 等分的細胞進行計數(shù)。如果使用臺盼藍評估活力，對于 ≥ 1 x 10 6 個細胞，至少添加 20 μL 培養(yǎng)基并記錄添加的培養(yǎng)基體積。對于 < 1 x 10 6 個細胞，直接用 20 μL 臺盼藍稀釋。將稀釋的等分試樣放在一邊，直到第 13 步。

重要提示：必須對解凍后（洗滌前）立即收集的等分試樣進行活細胞計數(shù)。這將確認提供的細胞數(shù)量，并跟蹤洗滌過程中潛在的細胞損失。在洗滌步驟中，預計細胞損失高達 30%。

•  使用移液器將剩余的細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到 50 mL 錐形管中。
•  用 1 mL 培養(yǎng)基沖洗小瓶并將其逐滴添加到細胞中，同時輕輕旋轉(zhuǎn) 50 mL 管。
•  通過逐滴添加 15-20 mL 的介質(zhì)進行清洗，同時輕輕旋轉(zhuǎn)管子。
• 在室溫 (15 - 25°C) 下 以 300 x g 離心細胞懸液10 分鐘。
•  如果使用臺盼藍，對第 8 步稀釋的等分試樣進行細胞計數(shù)。
•  用移液器小心地去除上清液，留下少量培養(yǎng)基以確保細胞沉淀不受干擾。輕輕彈動試管重懸細胞沉淀。
•  如果細胞開始結(jié)塊，每毫升細胞懸浮液加入 100 μg DNase I 溶液，并在室溫下孵育 15 分鐘。

注意：如果細胞將用于 DNA 或 RNA 提取，請勿添加 DNase I 溶液。

•  輕輕地將 15-20 mL 的介質(zhì)添加到管中。
• 在室溫下 以 300 x g 離心細胞懸液10 分鐘。
•  用移液器小心去除上清液，留下少量培養(yǎng)基以確保細胞沉淀不受干擾。輕輕彈動試管重懸細胞沉淀。

解凍后的 細胞即可用于下游應用。

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