蛋白免疫印跡技術(shù)（免疫印跡試驗(yàn)）即Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。蛋白免疫 印跡技術(shù)主要用于檢測或分析蛋白，例如用酵母表達(dá)某種目的蛋白，把基因克隆到宿主后，要檢測目的蛋白的表達(dá)就可以用western blot。

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)背景

20 世紀(jì) 70 年代，Southern 教授發(fā)明了檢測 DNA 的方法，命名為 Southern blot。之后，隨著技術(shù)的發(fā)展，另一位科學(xué)家發(fā)明了檢測 RNA 的方法，由于其與 DNA 檢測相對(duì)應(yīng)，被稱為 Northern 印跡技術(shù)。在這些技術(shù)的基礎(chǔ)上，蛋白免疫印跡技術(shù) Western blot 逐漸發(fā)展起來。它借鑒了前兩者的原理，用于檢測和分析蛋白質(zhì)，成為分子生物學(xué)等領(lǐng)域的重要工具。

一、蛋白電泳：目前最常用的是SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳），在這一步蛋白質(zhì)會(huì)根據(jù)分子量大小分開，分子量小的會(huì)在膠的底部，分子量大的會(huì)在膠的頂部。

SDS也就是十二烷基硫酸鈉是帶負(fù)點(diǎn)的，它可以消除蛋白質(zhì)的電荷差異，只保留大小差異，使其都帶上負(fù)電，從而能在電場的作用下遷移。

二、轉(zhuǎn)膜：此步驟主要是將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，常用的是硝酸纖維素膜和PVDF（聚偏氟乙烯），膜具有與蛋白質(zhì)高度親和的能力，也就是說更容易與蛋白結(jié)合。

為什么要將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移到膜上進(jìn)行檢測呢？因?yàn)榈鞍纂娪緯r(shí)位于膠的內(nèi)部，而轉(zhuǎn)移到膜上位于膜的表面，更容易與之后的抗體結(jié)合。

那么如何將蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移到膜上呢？

    之前提到過蛋白質(zhì)在電泳作用下已經(jīng)帶上了負(fù)電，那么我們只需要在膠和膜的外面外加一個(gè)電場，蛋白就會(huì)向膜上移動(dòng)了。具體操作需要先做一個(gè)“三明治”，海綿墊、濾紙、膜、膠、濾紙、海綿墊（見圖），濾紙的作用是維持穩(wěn)定的流動(dòng)，而海綿墊則對(duì)整個(gè)系統(tǒng)起到穩(wěn)定的作用。

 然后將膜放在靠近正極的一側(cè)后我們將它放入轉(zhuǎn)膜槽進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，過程中我們會(huì)加入甲醇，由于甲醇可以使蛋白質(zhì)與SDS分離，加入甲醇可以使蛋白質(zhì)更好的結(jié)合膜。

三、封閉：前面提到膜與蛋白質(zhì)具有高度親和的能力，所以我們必須封閉空白著的結(jié)合位點(diǎn)，防止之后加的抗體與膜直接結(jié)合，也稱阻止非特異性結(jié)合。通常我們會(huì)用脫脂牛奶或者牛血清蛋白（BSA）作為緩沖液。

四：加抗體：一般先加第一抗體，一抗可以和我們的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，之后需要洗幾遍膜，將未結(jié)合的一抗洗掉，下一步加入第二抗體檢測，二抗是被標(biāo)記了的抗體，可以與一抗特異性結(jié)合，一個(gè)一抗可以和兩個(gè)甚至更多的二抗結(jié)合，放大檢測信號(hào)，同樣二抗孵育完也要把未結(jié)合的二抗洗去。

五、檢測：二抗通常會(huì)用堿性磷酸化酶或辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記，最后當(dāng)我們加入底物時(shí)，HRP就會(huì)引起化學(xué)發(fā)光，從而使我們能夠看到目的條帶。而后用膠片曝光就得到了最終結(jié)果。

蛋白免疫印跡技術(shù)注意事項(xiàng)

 ? 轉(zhuǎn)膜時(shí)濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會(huì)造成短路。

 ? 轉(zhuǎn)膜時(shí)間一般為1.5 小時(shí)，需要根據(jù)分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)膜時(shí)間和電流大小。

 ? 為避免出現(xiàn)信號(hào)低的情況，可以選用高靈敏度的發(fā)光液，如ECL發(fā)光液等。  

Western blot蛋白免疫印跡技術(shù)不僅是大部分實(shí)驗(yàn)的重要基礎(chǔ)，更是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中常見的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。因其操作原理與眾多實(shí)驗(yàn)具有相似性，所以扎實(shí)掌握這一技術(shù)，對(duì)其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)的學(xué)習(xí)也大有裨益。更多電泳儀，電泳槽，化學(xué)發(fā)光成像儀，凝膠成像儀等Western blot實(shí)驗(yàn)室儀器，實(shí)驗(yàn)耗材以及生物試劑可以進(jìn)入蘇州阿爾法生物網(wǎng)站進(jìn)行了解， 0512-62956104或18934597460.

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