貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)是生物學(xué)研究中常常遇到的基本實(shí)驗(yàn)。

一、目的
建議使用以下方案作為 貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)的基本指導(dǎo)。

二、責(zé)任
所有經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)室人員都有責(zé)任執(zhí)行并遵守程序的所有方面。管理層有責(zé)任驗(yàn)證執(zhí)行規(guī)定程序的技術(shù)方面人員的資格。

三、細(xì)胞生物學(xué)中常見(jiàn)的名詞定義：

1.類(lèi)上皮細(xì)胞——細(xì)胞呈多邊形，尺寸更規(guī)則，并以不連續(xù)的斑塊附著在基質(zhì)上生長(zhǎng)。

2.成纖維細(xì)胞（或成纖維細(xì)胞樣）——在基質(zhì)上生長(zhǎng)的細(xì)胞看起來(lái)細(xì)長(zhǎng)且雙極，在重度培養(yǎng)中經(jīng)常形成漩渦。

3.永生或連續(xù)細(xì)胞系——已適應(yīng)在培養(yǎng)物中無(wú)限期生長(zhǎng)的細(xì)胞。

4.淋巴母細(xì)胞樣 – 球形細(xì)胞，通常在懸浮液中生長(zhǎng)，不附著在表面上。

5.單層培養(yǎng)系統(tǒng)——主要生長(zhǎng)在均勻?qū)又械牟ＡЩ蛱幚磉^(guò)的塑料上的細(xì)胞。

6.傳代數(shù)——細(xì)胞經(jīng)歷的傳代培養(yǎng)次數(shù)。傳代數(shù)應(yīng)與每個(gè)亞培養(yǎng)物一起記錄。

7.原代培養(yǎng)——源自有機(jī)體并置于合適培養(yǎng)環(huán)境中的細(xì)胞。

8.衰老——分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的累積變化會(huì)隨著時(shí)間的推移破壞新陳代謝，導(dǎo)致惡化并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

9.繼代培養(yǎng)或傳代——去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞從以前的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，使細(xì)胞系能夠繼續(xù)繁殖。

10.懸浮培養(yǎng)系統(tǒng) – 培養(yǎng)系統(tǒng)中的自由漂浮細(xì)胞。

11.組織培養(yǎng)——從動(dòng)物或植物中取出細(xì)胞、組織或器官，然后置于有利于生長(zhǎng)的人工環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程。

四、貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)需要的實(shí)驗(yàn)室 設(shè)備
實(shí)驗(yàn)設(shè)備將針對(duì)指定用途進(jìn)行適當(dāng)設(shè)計(jì)，并適當(dāng)放置和安裝以方便操作，包括清潔和維護(hù)。實(shí)驗(yàn)室儀器將根據(jù)既定程序和時(shí)間表進(jìn)行清潔、消毒、維護(hù)和校準(zhǔn)。培養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中通常會(huì)用到的實(shí)驗(yàn)室儀器如下：

1.移液器，移液槍?zhuān)╮ainin）

2.水浴鍋

3.溫度計(jì)

4.倒置光學(xué)顯微鏡

5.離心機(jī)

6.CO2 培養(yǎng)箱，能夠在 5% CO2 的濕潤(rùn)氣氛下維持 37°C

實(shí)驗(yàn)耗材和實(shí)驗(yàn)試劑
培養(yǎng)容器包含處于健康生長(zhǎng)階段的細(xì)胞或冷凍保存的細(xì)胞，這些細(xì)胞在冷凍保存前至少有 90% 的存活率。細(xì)胞培養(yǎng)操作中使用的實(shí)驗(yàn)耗材主要包括離心管、培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、無(wú)菌一次性培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板、移液器吸頭、一次性移液管、乳膠手套等；液體培養(yǎng)基和添加劑、血清等。還包括實(shí)驗(yàn)室消毒液、細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、0.4%臺(tái)盼藍(lán)、抗生素和適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)添加劑、不含鈣鎂的平衡鹽溶液、適用于細(xì)胞類(lèi)型的牛血清等

細(xì)胞規(guī)格
培養(yǎng)物應(yīng)保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（70-80% 匯合）。培養(yǎng)條件取決于細(xì)胞系。所有與細(xì)胞培養(yǎng)物接觸的溶液、設(shè)備和耗材都必須是無(wú)菌的。絕不能同時(shí)處理不同的細(xì)胞系。在準(zhǔn)備不同類(lèi)型的細(xì)胞之間，應(yīng)徹底清潔所有工作區(qū)域。

預(yù)防措施
穿戴個(gè)人防護(hù)裝備。使用適當(dāng)?shù)臒o(wú)菌技術(shù)。

貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)步驟

1. 細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基的制備。

A. 檢查與細(xì)胞系有關(guān)的信息，以確定應(yīng)使用何種培養(yǎng)基類(lèi)型、添加劑和建議。遵循制造商對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)容器工作體積的建議。

B. 基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充有 5-20% 的牛血清，通常還添加抗生素、生長(zhǎng)因子、氨基酸或糖。一旦補(bǔ)充基礎(chǔ)培養(yǎng)基以產(chǎn)生完全培養(yǎng)基，它通常可以在 4°C 下穩(wěn)定 6 周。

2. 細(xì)胞檢查

A. 應(yīng)經(jīng)常在顯微鏡下檢查細(xì)胞，以確保它們健康并按預(yù)期生長(zhǎng)。貼壁細(xì)胞應(yīng)主要貼附在燒瓶底部，呈圓形、豐滿(mǎn)或細(xì)長(zhǎng)的形狀，并在其膜周?chē)凵涔饩€(xiàn)。檢查與細(xì)胞系有關(guān)的信息，以確定應(yīng)使用何種培養(yǎng)基類(lèi)型、添加劑和建議。遵循制造商對(duì)培養(yǎng)容器工作體積的建議。

B. 觀(guān)察培養(yǎng)細(xì)胞的健康狀況、形態(tài)、匯合度百分比、細(xì)胞碎片、污染等。

C. 如果細(xì)胞大量脫落并且看起來(lái)干癟、呈顆粒狀或顏色深，或者它們似乎根本沒(méi)有生長(zhǎng)，或者看起來(lái)已被污染，則丟棄細(xì)胞。

3. 拆分比率

A. 分流比可用于確保細(xì)胞應(yīng)為實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。查看正在使用的細(xì)胞系的指南。如果使用高分流比，一些生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞可能不會(huì)生長(zhǎng)。一些快速生長(zhǎng)的細(xì)胞可能需要高分流比以確保它們不會(huì)過(guò)度生長(zhǎng)。作為一般指南：

A. 1:2 分流應(yīng)達(dá)到 70-80% 匯合，并可在 1-2 天內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

B. 1:5 分流應(yīng)達(dá)到 70-80% 的融合度，并可在 2-4 天內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

B. 如果細(xì)胞匯合度低于 70-80% 但需要傳代培養(yǎng)，則應(yīng)以較低的比例分流，以便以足夠高的密度接種細(xì)胞以使其存活。

4. 繼代培養(yǎng)或傳代

A. 從培養(yǎng)容器中取出并丟棄用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)基。

B. 使用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液清洗細(xì)胞。

A. 每 10cm2 培養(yǎng)表面積約 2mL。輕輕地將洗滌液添加到容器與附著的細(xì)胞層相對(duì)的一側(cè)，以避免干擾細(xì)胞層。輕輕來(lái)回?fù)u動(dòng)容器數(shù)次以清洗細(xì)胞層。

B. 從培養(yǎng)容器中取出并丟棄洗滌液。

C. 重復(fù)洗滌步驟，共洗滌兩次。

C. 將預(yù)熱的解離試劑添加到燒瓶的一側(cè)。使用足夠的試劑覆蓋細(xì)胞層，每 10cm2 約 0.5ml。輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)容器，使解離試劑完全覆蓋細(xì)胞層。

A. 在室溫下孵育培養(yǎng)容器約 2-3 分鐘。實(shí)際孵育時(shí)間因使用的細(xì)胞系而異。難以分離的細(xì)胞可置于 37°C 以促進(jìn)分散。

B. 在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞是否脫離。如果細(xì)胞分離率低于 90%，則將孵育時(shí)間增加幾分鐘，每 30 秒檢查一次解離情況。

a. 分離的細(xì)胞呈圓形并處于懸浮狀態(tài)。根據(jù)細(xì)胞系的不同，培養(yǎng)容器可以輕輕敲擊燒瓶的側(cè)面。注意：為避免結(jié)塊，在胰蛋白酶中不要通過(guò)敲擊來(lái)攪動(dòng)細(xì)胞。

b. 不要讓細(xì)胞在解離培養(yǎng)基中停留超過(guò) 10 分鐘。

C. 吸出細(xì)胞懸液并轉(zhuǎn)移到錐形管中。

D. 添加相當(dāng)于 2 體積的預(yù)熱完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基。通過(guò)在細(xì)胞層表面上吹打幾次來(lái)分散介質(zhì)。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到離解介質(zhì)中含有細(xì)胞的管中。細(xì)胞懸浮液可以計(jì)數(shù)用于冷凍保存，或者細(xì)胞可以離心用于傳代培養(yǎng)。

E. 以 200-1000xg 離心細(xì)胞 5 到 10 分鐘。離心速度和時(shí)間將根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型而有所不同。

F. 將細(xì)胞沉淀重新懸浮在最小體積的預(yù)熱完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，并取出樣本進(jìn)行計(jì)數(shù)。

G. 將細(xì)胞懸液稀釋至細(xì)胞系推薦的接種密度或分流比。將適當(dāng)?shù)捏w積吸取到新的培養(yǎng)容器中，然后將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱。

更換培養(yǎng)基

A. 如果細(xì)胞在幾天內(nèi)生長(zhǎng)良好但尚未融合，則可能需要更換培養(yǎng)基以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。如果懸浮液中有大量細(xì)胞或培養(yǎng)基 pH 值開(kāi)始變酸，請(qǐng)更換細(xì)胞培養(yǎng)基。

B. 將完整培養(yǎng)基加熱至 37°C。小心地從培養(yǎng)容器中吸出培養(yǎng)基并丟棄。更換為新鮮的預(yù)熱完全培養(yǎng)基并返回培養(yǎng)箱。

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