在自身免疫、免疫缺陷和癌癥中，受刺激的 T 細胞中細胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)可能會被破壞。刺激依賴性細胞因子調(diào)節(jié)劑的系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)需要功能喪失和功能獲得研究，這在人類原代細胞中一直具有挑戰(zhàn)性。通過報告人類原代 T 細胞中的全基因組 CRISPR 激活 (CRISPRa) 和干擾 (CRISPRi) 篩選，以識別控制白介素-2 (IL-2) 和干擾素-γ (IFN-γ) 產(chǎn)生的基因網(wǎng)絡。

CRISPR 激活與干擾篩選技術概述

《科學》雜志中關于CRISPR 激活、篩選有新進展，CRISPR 激活 (CRISPRa) 和 CRISPR 干擾 (CRISPRi) 篩選是測試基因功能得失的強大工具，但它們的使用在很大程度上僅限于永生化細胞系。Smite等人報告了一種優(yōu)化方法，使他們能夠對人類原代 T 細胞進行全基因組 CRISPRa 和 CRISPRi 篩選。然后，這種方法被用來檢查調(diào)節(jié)關鍵治療相關細胞因子產(chǎn)生的基因。然后將合并的 CRISPRa 擾動與單細胞 RNA 測序 (CRISPRa Perturb-seq) 相結合，使他們能夠探究細胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)劑如何控制 T 細胞活化并編程為不同的活化后狀態(tài).

人類 T 細胞對抗原刺激的反應，包括細胞因子的產(chǎn)生，對健康的免疫功能至關重要，并且可能在自身免疫、免疫缺陷和癌癥中失調(diào)。系統(tǒng)地了解調(diào)節(jié) T 細胞激活與功能獲得和功能喪失基因擾動的調(diào)節(jié)劑將提供對疾病途徑的更多見解，并為設計下一代免疫療法提供更多機會。

CRISPR 激活與干擾篩選的基本原理

盡管 CRISPR 激活 (CRISPRa) 和 CRISPR 干擾 (CRISPRi) 篩選是在永生化細胞系中進行功能獲得和功能喪失研究的強大工具，但在原代細胞類型中大規(guī)模部署它們一直具有挑戰(zhàn)性。在這里，研究團隊在原代人類 T 細胞中開發(fā)了一個 CRISPRa 和 CRISPRi 發(fā)現(xiàn)平臺，并對響應刺激的細胞因子產(chǎn)生的功能調(diào)節(jié)劑進行了全基因組篩選。由于 T 細胞中內(nèi)源白介素-2 (IL-2) 產(chǎn)生或 CD8 中干擾素-γ (IFN-γ) 產(chǎn)生的水平，通過熒光激活細胞分選到高和低箱中分離 CRISPRa 擾動細胞池+ T 細胞。命中包括近端 T 細胞受體 (TCR) 信號通路基因，表明這些成分的過表達可以克服信號“瓶頸”并調(diào)節(jié)刺激和細胞因子的產(chǎn)生。

使用 CRISPRi 的互惠全基因組功能喪失篩選檢測到具有關鍵調(diào)節(jié)功能的命中，包括 CRISPRa 遺漏的一些命中。相比之下，CRISPRa 還發(fā)現(xiàn)了可能不需要的命中，在某些情況下，在篩選條件下僅以低水平表達。核因子 κ B (NF-κB) 信號通路對 IFN-γ 產(chǎn)生的調(diào)節(jié)有力地證明了這一點，其中 CRISPRi 確定了所需的 TCR-NF-κB 信號通路（包括MALT1和BCL10）。CRISPRa 選擇性地檢測到一組也通過 NF-kB 發(fā)出信號的腫瘤壞死因子超家族受體，包括 4-1BB、CD27、CD40 和 OX40。在他們的實驗條件下，這些受體并不是單獨信號傳導所必需的，但在過度表達時可以促進 IFN-γ。因此，CRISPRa 和 CRISPRi 在功能性細胞因子調(diào)節(jié)劑的全面發(fā)現(xiàn)方面相互補充。陣列 CRISPRa 擾動驗證了關鍵命中對 CD4 +和 CD8 + T 細胞的影響。他們還通過測量一組分泌的細胞因子和趨化因子，評估了單個 CRISPRa 擾動如何更廣泛地重新編程 IL-2 和 IFN-γ 之外的細胞因子產(chǎn)生。

新平臺的開發(fā)與支持

Smite團隊還開發(fā)了一個平臺，用于在原代人類 T 細胞中結合單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 讀數(shù) (CRISPRa Perturb-seq) 進行合并 CRISPRa 擾動。他們使用 CRISPRa Perturb-seq 對由 70 個全基因組篩選命中和對照引起的單細胞狀態(tài)進行深度分子表征，以揭示細胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)劑如何調(diào)節(jié) T 細胞活化并將細胞編程為不同的刺激響應狀態(tài)。

他們的研究證明了一個強大的平臺，用于在原代人類 T 細胞中大規(guī)模匯集 CRISPRa 和 CRISPRi。成對的 CRISPRa 和 CRISPRi 篩選能夠對可以調(diào)節(jié)細胞因子產(chǎn)生的基因網(wǎng)絡進行全面的功能定位。通過陣列表型分析和匯集的 scRNA-seq 方法對 CRISPRa 命中進行跟蹤，可以對關鍵篩選命中進行精確的功能表征，揭示關鍵擾動如何將 T 細胞調(diào)整到治療相關狀態(tài)。未來在原代細胞中進行的 CRISPRa 和 CRISPRi 篩選可以確定改進的下一代細胞療法的目標。

研究學家Arrayed CRISPRa 確認了關鍵命中并啟用了多重分泌組表征，揭示了重塑的細胞因子反應。將 CRISPRa 篩選與單細胞 RNA 測序相結合，可以對篩選命中進行深度分子表征，揭示了擾動如何調(diào)節(jié) T 細胞活化并促進以不同細胞因子表達譜為特征的細胞狀態(tài)。這些篩選揭示了重新編程關鍵免疫細胞功能的基因，這也為免疫療法的設計提供參考。

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