建立石蠟/新鮮組織總RNA提取操作規(guī)程。

范圍：

適用石蠟/新鮮組織總RNA提取的操作。

職責(zé)：

研發(fā)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)維護(hù)本制度的適用性和執(zhí)行有效性，并對(duì)RNA提取的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)督。

內(nèi)容：

實(shí)驗(yàn)前試劑材料準(zhǔn)備與檢查工作如下：

1. 圖1：天根提取試劑盒
   
2. 
   
3. RNA提取試劑盒（天根；常溫放置）
4. 裂解液RL
5. RNase-Free DNase I干粉(天根；保存
   在2-8℃)

無水乙醇；

1. β-巰基乙醇
2. RNase-free高壓滅菌的1.5ml EP管；
3. RNase-free高壓滅菌的各類移液槍頭；
4. RNase-free水。

操作步驟

第一部分:組織前處理：

1. 石蠟組織前處理：
2. 取1ml二甲苯置于1.5ml EP管中，用管中二甲苯?jīng)_淋玻片，在濕潤時(shí)用刀片刮取石蠟組織至EP管中，共刮取4至8片石蠟玻片(或切取2-8片5-15 μm厚的石蠟切片)，不超過8片；
   

圖2：石蠟玻片組織樣本處理

圖3：石蠟包埋組織樣本處理

1. 震蕩混勻器上強(qiáng)力振蕩20s，18000rpm室溫離心3min，用微量移液器去除上清，小心不要移走沉淀的組織塊(可以適情況重復(fù)上面步驟一次)；
2. 加1ml無水乙醇至EP管，震蕩混勻后，18000rpm室溫離心3min，移除上清，小心不要移走沉淀的組織塊；
3. 打開管蓋，37℃揮發(fā)5-10min(或至酒精均已揮發(fā)無酒精味)；
4. 新鮮組織前處理：

采用一次性的剪刀或刀片將新鮮組織塊（10-20mg）在含有300μl裂解液RL（使用前檢查是否加入1%的β-巰基乙醇）的滅菌1.5mLEP管中分割成小組織塊（盡量減碎）。

第二部分：組織消化：

1. 石蠟組織消化：加入200ul裂解液RF 以及10ul蛋白酶K 于沉淀中，徹底渦旋混勻；55℃孵育30～60 min 之后80℃孵育15 min。
2. 新鮮組織消化：加入590ulRNase-Free ddH2O和10ul蛋白酶K于沉淀中，混勻后56℃處理60min。

圖4：組織消化

第三部分：RNA吸附

1. 室溫(20-25℃)，12,000 rpm(～13,400×g)離心5 min，轉(zhuǎn)移上清入新的RNase-free離心管中；
   

圖5：轉(zhuǎn)移上清

1. 石蠟樣本：加入220ul的緩沖液RB，渦旋混勻，加入660ul的無水乙醇；新鮮組織：緩慢加入0.5倍上清體積無水乙醇。
   

圖6：加入0.5倍上清體積無水乙醇

1. 混勻（此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀），轉(zhuǎn)移700μl溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中（吸附柱放在收集管中），12,000 rpm(～13,400×g)離心30～60 sec，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中；
   

圖7：混合液轉(zhuǎn)移

1. 重復(fù)上一步驟，直到所有的溶液和沉淀完全通過吸附柱CR3，棄廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。

第四部分：DNase消化：

1. 向吸附柱CR3中加入350ul去蛋白液RW1，12,000 rpm(13,400×g)離心30-60s，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。（對(duì)于新鮮組織，此步驟可以省去）；
   

圖8：去蛋白液洗滌

1. DNase I儲(chǔ)存液的配制：將DNase I干粉溶解在500ul RNase-free水中，輕柔混勻，分裝（50ul/管）后-20℃儲(chǔ)存（可保存9個(gè)月），每次按照實(shí)驗(yàn)要求取出。請(qǐng)注意將融化的DNase I的儲(chǔ)存液置于4℃儲(chǔ)存（可保周），請(qǐng)勿再次凍存；
   

加水
揭蓋
輕柔混勻

分裝
-20℃儲(chǔ)存（可保存9個(gè)月）
圖9：DNase儲(chǔ)存液配制

1. DNase I工作液的配制：取50ulDNaseI儲(chǔ)存液放入新的RNase-Free離心管中，加入350 ulRDD溶液，輕柔混勻；
   

圖10：DNase工作液配置

1. 向吸附柱CR3 中央加入80ul的DNase I 工作液，室溫放置15min；

圖11：DNase室溫消化15min

第五部分：RNA洗脫

1. 向吸附柱CR3 中加入500ul去蛋白液RW1，室溫(20~25℃)，12,000rpm(～13,400×g) 離心30-60s，棄廢液，將吸附柱放回收集管中；
2. 向吸附柱CR3 中加入500ul漂洗液RW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇）， 室溫靜置2min，12,000 rpm(~13,400×g)離心30-60s，棄廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；
   

圖12：漂洗液RW洗滌

1. 重復(fù)上述步驟；
2. 室溫(20~25℃)，12,000 rpm(~13,400×g)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CR3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
3. 將吸附柱CR3 轉(zhuǎn)入一個(gè)新的RNase-free 離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30-100ulRNase-free ddH2O，室溫放置2min，12,000 rpm(~13,400×g)離心2min，得到RNA 溶液。
4. 在管壁和管蓋上標(biāo)清樣本唯一性編號(hào)；
5. 將RNA用于后續(xù)操作或凍存在-80℃；
6. 及時(shí)做好紙質(zhì)和電子文檔記錄。

第六部分 RNA質(zhì)量檢測(cè)

1. 完整性：瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性。由于固定和包埋的條件限制，F(xiàn)FPE樣本核酸通常發(fā)生片段化并且會(huì)被甲醛化學(xué)修飾，因此較難提取，本試劑盒提取的RNA可應(yīng)用于RT-PCR等下游試驗(yàn)。
   

圖13：漂洗液RW洗滌
該試劑盒能可從新鮮組織中快速提取總RNA，可同時(shí)處理大量不同樣品。提取的總RNA純度極高，沒有蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)污染。例如利用該試劑盒分離大鼠不同組織總RNA， 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在7~15kb處，高分子RNA（mRNA和 hnRNA）呈不連續(xù)的帶狀分布，在5kb（28S）和2kb（18S）有兩條主要條帶。

1.      純度分析：OD260/OD280 比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的指標(biāo)。高質(zhì)量的 RNA，OD260/OD280 讀數(shù)在1.8-2.1 之間，比值為2.0 是高質(zhì)量RNA 的標(biāo)志。OD260/OD280 讀數(shù)受測(cè)定所用溶液的pH 值影響。同一個(gè)RNA 樣品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中測(cè)出的OD260/OD280 讀數(shù)1.8-2.1 之間，在水溶液中所測(cè)讀數(shù)則可能在1.5-1.9 之間，但這并不表示RNA 不純。
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3. 蘇州阿爾法生物提供的天根試劑盒包括DNA提取試劑盒，RNA提取試劑盒，質(zhì)粒小提試劑盒，膠回收試劑盒，ELsias試劑盒等。所有產(chǎn)品均低于天根官網(wǎng)的目錄價(jià)，詳細(xì)了解撥打0512-62956104或18934597460.
   
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