由于T細(xì)胞具有多種亞型，所以研究膜結(jié)合T細(xì)胞受體的技術(shù)困難，但在某些情況下，您希望能夠做到這一點(diǎn)，例如分析哪些免疫記憶已被誘導(dǎo)以測量個體對特定抗原的反應(yīng)程度。此時， 有多種方法可以實(shí)現(xiàn)，主要分為兩大類：一種是通過測量特征性反應(yīng)（例如細(xì)胞因子分泌）來檢測 T 細(xì)胞對刺激作出反應(yīng)的激活，另一種是通過細(xì)胞的特異性來分析T細(xì)胞受體。

下面總結(jié)了一下 T細(xì)胞分析的6種方法：

1. 限制稀釋培養(yǎng)

該技術(shù)涉及通過使用不同稀釋度的細(xì)胞來測量對特定抗原產(chǎn)生反應(yīng)的 T 細(xì)胞的頻率，然后測量無反應(yīng)的孔數(shù)。

不用過多計算，簡而言之，每個孔中活性 T細(xì)胞的分布應(yīng)遵循泊松分布隨機(jī)分布原則。我們可以使用這些信息來計算我們擁有的活躍 T 細(xì)胞的數(shù)量。從泊松分布中我們知道，如果反應(yīng)陰性的孔比例為 37%，那么每個孔中平均有一個抗原特異性 T 細(xì)胞。因此讀取產(chǎn)生 37% 陰性孔的細(xì)胞數(shù)，然后我們可以計算響應(yīng)細(xì)胞的頻率。例如，如果以每孔 5000 個細(xì)胞接種細(xì)胞導(dǎo)致 37% 的細(xì)胞呈陰性，我們知道我們有 1/5000 個活躍細(xì)胞的頻率。啟動或免疫小鼠后，頻率相應(yīng)增加，就表明抗原正在驅(qū)動增殖。

2. ELISPOT

如果需要對細(xì)胞進(jìn)行表型分析，有限稀釋培養(yǎng)法就顯得費(fèi)力些。此時可以可以通過細(xì)胞因子的產(chǎn)生來測量 T 細(xì)胞的反應(yīng)，即：ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)）進(jìn)行檢測。

方法步驟如下：在使用非反應(yīng)性血清進(jìn)行封閉之前，可以在 PVDF（聚偏二氟乙烯）覆蓋的微孔板上涂上單克隆或多克隆抗體，并將板上的 T 細(xì)胞與一種或多種物質(zhì)一起培養(yǎng)以激活細(xì)胞因子的分泌。然后細(xì)胞因子被包被的抗體捕獲。接下來，在添加二抗之前清洗板以去除碎片、未結(jié)合的抗體和培養(yǎng)基，二抗與顯色（著色）底物（通常是帶有辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的鏈霉親和素）偶聯(lián)，然后再次洗滌。然后，您可以將目的細(xì)胞因子視為可見點(diǎn)，并分別使用顯微鏡手動或自動使用自動閱讀器對其進(jìn)行計數(shù)。這種方法的缺點(diǎn)在于 雖然量化產(chǎn)生抗體的 T 細(xì)胞的數(shù)量方面相對較多，但在描述單個細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生譜時仍然受到限制。

3. 細(xì)胞內(nèi)染色

細(xì)胞內(nèi)染色是指在固定和透化細(xì)胞之前用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（例如莫能菌素或布雷菲爾德菌素）處理來抑制細(xì)胞因子的分泌，并針對您的細(xì)胞因子的熒光標(biāo)記抗體，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測量的方法。其缺點(diǎn)在于會殺死細(xì)胞 。

4. 細(xì)胞因子捕獲

細(xì)胞因子捕獲法的原理是來自不同抗體的兩個重鏈和輕鏈對組合在一起，得到帶有兩個不同配體的兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的雜交抗體。這些雙特異性抗體可用于檢測細(xì)胞因子。一種配體是 T 細(xì)胞特異的標(biāo)記物，另一種是目標(biāo)細(xì)胞因子特異的標(biāo)記物?；罨?T 細(xì)胞用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑處理，因此細(xì)胞因子在細(xì)胞內(nèi)積累。然后使用雜交抗體來捕獲和檢測 T 細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞因子。甲雜交抗體可用于執(zhí)行此操作。雜交抗體由對目標(biāo)細(xì)胞因子和常見細(xì)胞表面蛋白（如 MHC I 類）特異的抗體制成。雜交抗體結(jié)合活化的 T 細(xì)胞。如果 T 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，則與細(xì)胞表面結(jié)合的雜交抗體會捕獲它們。然后使用針對目標(biāo)細(xì)胞因子的標(biāo)記二抗檢測分泌細(xì)胞因子的 T 細(xì)胞。

5. 四聚體染色

T 細(xì)胞反應(yīng)也可以通過其受體的特異性來測量，使用熒光標(biāo)記的四聚體或特定的 MHC：肽復(fù)合物。MHC ：肽四聚體由重組 MHC 分子制成，其中特定肽與生物素-鏈霉親和素結(jié)合。表達(dá)相應(yīng)特異性的 T 細(xì)胞結(jié)合這些四聚體。然后對這些進(jìn)行染色以進(jìn)行檢測，并可以通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析！

6. 光譜分析和生物傳感器檢測

T細(xì)胞群的多樣性可以通過光譜分析來定義。在這里，CDR3 區(qū)域通過凝膠電泳可視化，讓您可以比較表達(dá)相同 V 段的受體。然后可以使用生物傳感器測定來測量配體與其互補(bǔ)抗原受體的結(jié)合和解離率。

待測配體固定在鍍金表面。然后使可溶性 T 細(xì)胞受體與結(jié)合的配體接觸并結(jié)合。一段時間后，他們分離?？梢允褂蒙飩鞲衅鲗?shí)時測量發(fā)生這種情況的速率。附著和脫離的速率由生物傳感器監(jiān)測，該生物傳感器可以有效進(jìn)行全內(nèi)反射并 結(jié)合對玻璃芯片表面偏振光源的影響來測量鍍金玻璃芯片表面分子的結(jié)合. 它檢測反射光束的角度和強(qiáng)度的任何波動，并將其與時間繪制成圖以創(chuàng)建“傳感圖” 。

也可以結(jié)合受體而不是配體。當(dāng)系統(tǒng)飽和或達(dá)到結(jié)合和解離之間的平衡狀態(tài)時，達(dá)到最大結(jié)合后，曲線將趨于穩(wěn)定，表明不再發(fā)生結(jié)合。然后可以洗掉未結(jié)合的分子，在繼續(xù)洗滌后，它們都開始從它們結(jié)合的蛋白質(zhì)上脫落。測量相互作用的曲線將開始下降，顯示發(fā)生解離的速率。

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