本節(jié)介紹細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和簡(jiǎn)單的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)步驟和方法。由于其中一些實(shí)驗(yàn)方法可能需要進(jìn)行修改才能適應(yīng)對(duì)應(yīng)細(xì)胞類型的需求。

分離貼壁細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)

隨著時(shí)間的推移，體外培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)耗盡培養(yǎng)基中提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，釋放有毒代謝物并持續(xù)增加。為了擴(kuò)大和維持健康的細(xì)胞培養(yǎng)物，因此只能使用來(lái)自原始培養(yǎng)物的細(xì)胞亞群生產(chǎn)新的培養(yǎng)物，去除有毒副產(chǎn)物，并用新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。這樣的細(xì)胞培養(yǎng)方式叫做細(xì)胞的繼代培養(yǎng)。

繼代培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)步驟：

當(dāng)貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)達(dá)到約 80% 的匯合度時(shí)，就達(dá)到了合適的傳代時(shí)間。

1.此時(shí)的細(xì)胞可以被酶消化或機(jī)械解離以剝離它們的底物。在生物安全柜中，用不含 Mg 2+和 Ca 2+的磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 洗滌細(xì)胞去除死細(xì)胞并在 37°C 下與足夠的消化酶或螯合劑（例如胰蛋白酶、分散酶、膠原酶、乙二胺四乙酸 (EDTA)）一起孵育。

2.將錨定細(xì)胞從其底物和細(xì)胞間相互作用中分離所需的時(shí)間可能需要 1-60 分鐘，這取決于細(xì)胞類型和使用的消化酶。可以在光學(xué)顯微鏡下監(jiān)測(cè)解離的程度，一旦完成，輕敲培養(yǎng)容器應(yīng)該會(huì)去除剩余的貼壁細(xì)胞。

3.分離的細(xì)胞收集在無(wú)菌的 離心管中，培養(yǎng)容器也應(yīng)該用含有酶消化和細(xì)胞解離抑制劑的培養(yǎng)基清洗。

4.然后可以細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行濃縮和計(jì)數(shù)。

5.以所需濃度接種在新的培養(yǎng)容器中。比如細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器，較低的細(xì)胞濃度（~104 個(gè)細(xì)胞/mL) 適用于增殖速度快的細(xì)胞系，而較高的細(xì)胞濃度 (~10 5 個(gè)細(xì)胞/mL) 更適合于生長(zhǎng)速度較慢的細(xì)胞。

 注意：良好的實(shí)驗(yàn)室習(xí)慣是記錄自培養(yǎng)開(kāi)始以來(lái)發(fā)生的傳代次數(shù)。一些細(xì)胞系不適用于超過(guò)給定傳代數(shù)的實(shí)驗(yàn)工作，因?yàn)殡S著時(shí)間的推移，哺乳動(dòng)物系中的染色體異常往往會(huì)隨著細(xì)胞分裂而增加。

懸浮培養(yǎng)物的繼代培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)可以通過(guò)無(wú)菌去除三分之一的細(xì)胞懸浮溶液并用預(yù)熱的完全培養(yǎng)基替換體積來(lái)實(shí)現(xiàn)。

造粒細(xì)胞

為了濃縮細(xì)胞以轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞培養(yǎng)容器、冷凍或其他實(shí)驗(yàn)測(cè)定中，將細(xì)胞懸液以 300 × g離心10 分鐘。去除上清液后，通過(guò)輕輕上下吹打細(xì)胞 3 次，將細(xì)胞沉淀重新懸浮在所需培養(yǎng)基中。

注意：?jiǎn)渭?xì)胞可能非常脆弱，因此建議不要以更高的速度離心或大力吸移它們。

細(xì)胞定量和確定細(xì)胞活力

細(xì)胞可能在培養(yǎng)過(guò)程中或在處理和傳代過(guò)程中死亡。當(dāng)依賴特定濃度的活細(xì)胞開(kāi)始培養(yǎng)或需要特定數(shù)量的活細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定時(shí)，區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞很重要。在評(píng)估增長(zhǎng)率時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)也很有幫助。由于細(xì)胞通常以數(shù)百萬(wàn)計(jì)培養(yǎng)，因此首先以小體積計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，然后外推至整個(gè)細(xì)胞體積。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)基技術(shù)中將所有細(xì)胞都被分離、沉淀并均勻地重新懸浮在合適的培養(yǎng)基體積中。在用 0.4% 臺(tái)盼藍(lán) 1:1 稀釋時(shí)，將少量細(xì)胞懸液在離心管中混合。臺(tái)盼藍(lán)染料僅滲透無(wú)法存活的細(xì)胞，因此可以從后續(xù)定量中排除。

           這通過(guò)將 10 μL 臺(tái)盼藍(lán)中的細(xì)胞混合物加載到血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上來(lái)實(shí)現(xiàn)。使用倒置顯微鏡、相差和至少 10 倍的放大倍率，對(duì)位于四個(gè)外部正方形中的所有細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)?；罴?xì)胞包含較暗的“光暈”，而非活細(xì)胞則染成藍(lán)色/黑色。為了確定活細(xì)胞的總數(shù)，在所有四個(gè)方格中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞數(shù)除以 4（以確定 1 mm 2中的平均細(xì)胞數(shù)），乘以 10 4（以獲得每毫升的細(xì)胞數(shù)）乘以 2（以考慮臺(tái)盼藍(lán)的稀釋因子）并乘以整個(gè)細(xì)胞懸浮液的初始培養(yǎng)基體積?；罴?xì)胞的百分比可以通過(guò)將未染色的細(xì)胞數(shù)除以細(xì)胞總數(shù)，再乘以 100 來(lái)確定。健康細(xì)胞培養(yǎng)物的特征是 80-95% 的細(xì)胞活力。為避免步驟繁瑣，也可以直接使用細(xì)胞活力ATP檢測(cè)試劑盒。

上圖中 使用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞定量。  通過(guò)用蓋玻片覆蓋兩個(gè)計(jì)數(shù)室來(lái)制備血細(xì)胞計(jì)數(shù)器。隨后，將 10 μL 含有 0.4% 臺(tái)盼藍(lán)的 1:1 細(xì)胞懸液加載到其中一個(gè)計(jì)數(shù)室的填充槽口上。通過(guò)毛細(xì)作用，該體積將覆蓋可以在至少 10 倍放大率的倒置顯微鏡中觀察到的網(wǎng)格。覆蓋正方形 A-D 的細(xì)胞的平均值決定了每 mm 2的細(xì)胞數(shù)。這些正方形中的活細(xì)胞通過(guò)排除由于通過(guò)其可滲透細(xì)胞膜吸收臺(tái)盼藍(lán)而呈現(xiàn)黑色的非活細(xì)胞來(lái)計(jì)數(shù)。僅應(yīng)包括與外部水平和垂直邊界之一重疊的單元格。

細(xì)胞凍存方法

如果在傳代培養(yǎng)過(guò)程中有多余的細(xì)胞可用，則可以通過(guò)冷凍保護(hù)劑（例如甘油或二甲基亞砜 (DMSO)）將它們保存在該通道中，以防止有害的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)晶體的形成。為此，細(xì)胞從培養(yǎng)容器中分離出來(lái)，并進(jìn)行濃縮。將細(xì)胞沉淀重懸于 1 mL 冷凍培養(yǎng)基（例如補(bǔ)充有 10% DMSO 的敲除血清替代培養(yǎng)基）中，并將約 1 × 10 6 個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到每個(gè)冷凍管中。20-30 分鐘后，冷凍保護(hù)劑將滲透到細(xì)胞中。在 -80°C 下以 1–2°C/min 的受控冷凍速率冷卻過(guò)夜，然后將小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

       注意：雖然甘油和 DMSO 都是合適的冷凍保護(hù)劑，但需要仔細(xì)監(jiān)控 DMSO 的處理。在高（原液）濃度下，DMSO 對(duì)人員和培養(yǎng)細(xì)胞有毒，因此未經(jīng)事先稀釋不能添加到細(xì)胞中。這種毒性也會(huì)影響含有 10% DMSO 的冷凍培養(yǎng)基中的細(xì)胞，如果在室溫下放置數(shù)小時(shí)，則需要在 30 分鐘內(nèi)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 -80°C 進(jìn)行儲(chǔ)存。一般而言，應(yīng)佩戴化學(xué)防護(hù)手套，以保護(hù)人員免受 DMSO 及其溶質(zhì)容易穿透膜（包括皮膚）的危害。

解凍冷凍保存的細(xì)胞

大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以在液氮（<130°C）中保存多年，因?yàn)樗猩镞^(guò)程都在這些溫度下停止。為了回收細(xì)胞，將 10 mL 的完全培養(yǎng)基在水浴中預(yù)熱。從液氮中取出冷凍小瓶后，立即將其放入 37°C 水浴中并輕輕旋轉(zhuǎn)直至三分之二的內(nèi)容物完全解凍。用 70% 乙醇擦拭小瓶并放入生物安全柜中，將 1 mL 預(yù)熱的培養(yǎng)基以逐滴方式添加到部分解凍的小瓶中，以最大限度地減少 DMSO 稀釋時(shí)施加在細(xì)胞上的滲透應(yīng)力?，F(xiàn)在完全解凍的小瓶的內(nèi)容物也以逐滴方式轉(zhuǎn)移到剩余的 9 mL 完全培養(yǎng)基中，并以 300 × g離心3分鐘。吸出上清液后，細(xì)胞沉淀可在培養(yǎng)基中洗滌一次，以去除殘留的冷凍保存劑。然后將細(xì)胞重新懸浮在完全培養(yǎng)基中并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)容器中。細(xì)胞附著應(yīng)在 24 小時(shí)內(nèi)發(fā)生。

       注意：冷凍保存后細(xì)胞的活力受到其應(yīng)對(duì)冷凍和解凍壓力源的能力的影響。因此，建議盡快執(zhí)行解凍過(guò)程。當(dāng)處理已經(jīng)用甘油作為冷凍保護(hù)劑冷凍的冷凍管時(shí)，可以通過(guò)將冷凍保存的細(xì)胞直接稀釋十倍到完全預(yù)熱的培養(yǎng)基中來(lái)簡(jiǎn)化解凍過(guò)程，避免離心和洗滌步驟。

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