原代細(xì)胞的體外培養(yǎng)過程中，其生長時(shí)往往會混有多種不同類型的細(xì)胞。比如來自皮膚組織的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)可以出現(xiàn)表皮細(xì)胞與纖維下?lián)芡瑫r(shí)生長的情況。所以原代細(xì)胞的分離純化在初期細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)比較關(guān)鍵。

原代細(xì)胞的純化方法主要有以下幾種：

一、自然純化法：

原代細(xì)胞由于具有較強(qiáng)的增殖能力，因此可以采用通過長期多代傳代生物方式單獨(dú)培養(yǎng)某一類型的目的細(xì)胞，靠自然優(yōu)化的方式進(jìn)行細(xì)胞純化，這種方法的缺陷是無法按實(shí)驗(yàn)需求去自由去自由選擇要培養(yǎng)的細(xì)胞。而且培養(yǎng)周期較長，適合應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞系建立使用。

二、人工純化法：

人工純化的方法在細(xì)胞純化方面應(yīng)用較為廣泛，它是通過人工干預(yù)的方式，營造利于目的細(xì)胞生長的環(huán)境條件，從而抑制目的外細(xì)胞的生長從而達(dá)到細(xì)胞純化的一種純化方式。目前通用的主要有以下幾種：

 酶消化純化法：

根據(jù)上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞對胰蛋白酶的耐受能力是不相同的，所以采用酶消化的方式可以使這兩種細(xì)胞有效分開。這種純化方法不僅適用于貼壁細(xì)胞，同樣適用于半貼壁細(xì)胞和黏附細(xì)胞等。

操作步驟如下：

1.將0.25%胰蛋白酶分兩次加入25ML的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并輕搖勻。每次加入的量約為1ML左右，當(dāng)胰蛋白酶覆蓋細(xì)胞表面時(shí)，緩緩倒出。

2.擰上瓶蓋進(jìn)行細(xì)胞消化，在顯微鏡下觀察到纖維細(xì)胞部分脫落時(shí)，即可加入培養(yǎng)基停止消化。

3.在培養(yǎng)瓶上標(biāo)注不同類型的生長區(qū)域。加入培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)后即可分離。

機(jī)械刮分法：

在進(jìn)行貼壁培養(yǎng)時(shí)，不同類型的細(xì)胞往往會成片區(qū)狀混雜生長，我們可以使用細(xì)胞刮去除非目的細(xì)胞區(qū)域，具體操作步驟如下 ：

1.將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下，找出不同細(xì)胞類型的生長區(qū)域并用硅膠細(xì)胞刮劃分非目的細(xì)胞使其懸浮于培養(yǎng)基中，操作是需要注意不要傷及目的細(xì)胞。

2.加入適量培養(yǎng)基進(jìn)行沖洗，反而后繼續(xù)加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，如此反復(fù)多次即可達(dá)到純化分離效果。

反復(fù)貼壁培養(yǎng)法：

由于成纖維細(xì)胞的貼附速度優(yōu)于上皮細(xì)胞，一般情況下，10-30分鐘即可完成貼壁過程，而上皮細(xì)胞則需較長時(shí)間才能完成貼壁生長。利用這一原理分離純化細(xì)胞步驟如下：

1.在培養(yǎng)瓶內(nèi)加入適量的培養(yǎng)基，混入細(xì)胞懸液常溫下靜置20分鐘。

2.當(dāng)顯微鏡下觀察細(xì)胞開始出現(xiàn)貼壁時(shí)，緩緩搖動(dòng)后，將細(xì)胞懸浮液，輕導(dǎo)另一個(gè)培養(yǎng)瓶中，重復(fù)第一步操作。

3.重復(fù)多次后即可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的純化和分離。

原代細(xì)胞的分離和純化對于后續(xù)的傳代培養(yǎng)起著重要的作用，也會直接影響到細(xì)胞系的穩(wěn)定性，所以也可以多種方法綜合使用以增加細(xì)胞純化力度，盡可能保證原代細(xì)胞的可靠一致性。

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