單細(xì)胞技術(shù)主要研究?jī)?nèi)容主要有：?jiǎn)渭?xì)胞運(yùn)動(dòng)，單細(xì)胞生化活性，細(xì)胞牽引力等，單細(xì)胞技術(shù)研究方法有哪些？下面小編帶你一起來(lái)探尋。

細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的研究方法

細(xì)胞遷移在許多動(dòng)態(tài)過(guò)程中至關(guān)重要，例如血管生成、胚胎發(fā)育、傷口愈合和疾病進(jìn)展。如前所述，當(dāng)前的大部分知識(shí)體系都是從總體研究中產(chǎn)生的。然而，就細(xì)胞運(yùn)動(dòng)而言，只有選定的細(xì)胞才能進(jìn)行自由運(yùn)動(dòng)，并且通常由單個(gè)細(xì)胞引導(dǎo)，充當(dāng)向?qū)?。還表明，單細(xì)胞遷移模擬 3D 環(huán)境中的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。

圖 1. 1D 單細(xì)胞遷移研究使用微接觸印刷軌道讓細(xì)胞附著并沿其移動(dòng) (A)。另一種方法是懸浮單根纖維狀纖連蛋白（任何纖維狀基質(zhì)蛋白都可以），為細(xì)胞附著和遷移創(chuàng)造一個(gè)偽 3D 環(huán)境 (B)。

   有幾種方法可以研究單細(xì)胞遷移。一種流行的方法是使用微接觸印刷區(qū)域來(lái)創(chuàng)建“細(xì)胞軌跡”。這種方法可以輕松探索遷移的幾何限制。印刷區(qū)域可以具有多種形狀和圖案，以嚴(yán)格控制和探索廣泛的條件（圖 1A）。1D 軌跡研究已經(jīng)完成，表明細(xì)胞呈現(xiàn)出與天然 3D 基質(zhì)中的細(xì)胞非常相似的獨(dú)特形態(tài)和表型。為了充分探索這一現(xiàn)象，研究人員通過(guò)顯微打印創(chuàng)建了不同厚度的“軌跡”，然后涂上基質(zhì)蛋白纖連蛋白 (Fn) 。這一觀察結(jié)果在其他研究中得到了概括，包括在偽 3D 環(huán)境中對(duì) Fn 的單纖維進(jìn)行的研究（圖 1B）。單纖維研究利用內(nèi)皮細(xì)胞，并證明了不同機(jī)械應(yīng)變纖維的明顯細(xì)胞附著和遷移差異。尖端細(xì)胞遵循 Fn 初步矩陣在血管生成和血管生成中創(chuàng)建血管系統(tǒng)。在傷口愈合、疾病進(jìn)展和發(fā)展的動(dòng)態(tài)過(guò)程中，接受營(yíng)養(yǎng)和其他關(guān)鍵生物成分的能力是必不可少的。 在單細(xì)胞遷移中的這一發(fā)現(xiàn)提出了與所有這些過(guò)程相關(guān)的定向遷移理論，以及由于 Fn中的配體密度而對(duì) durotaxis 的機(jī)械洞察力。

  通過(guò)利用微流體平臺(tái)運(yùn)行不同種類的單細(xì)胞遷移測(cè)定。創(chuàng)建通道系統(tǒng)，細(xì)胞被困在某些區(qū)域，然后允許遷移穿過(guò)一部分。這些系統(tǒng)不僅過(guò)濾細(xì)胞，還允許遷移檢查。已經(jīng)在該系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行了癌癥研究，以確定癌細(xì)胞遷移能力的差異，以檢查轉(zhuǎn)移的根本原因。此外，該系統(tǒng)還有一個(gè)額外的好處，即能夠探索定向遷移，例如趨化性，還可以進(jìn)一步檢查具有遷移能力的細(xì)胞，以發(fā)現(xiàn)其他關(guān)鍵差異。已經(jīng)表明，與非轉(zhuǎn)移細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)移細(xì)胞對(duì)趨化梯度的反應(yīng)更大，并且顯示出較更高水平的 GTP 酶標(biāo)記物。

跟蹤細(xì)胞遷移的傳統(tǒng)方法也可以應(yīng)用于單個(gè)細(xì)胞。單細(xì)胞遷移的關(guān)鍵因素是起初減少細(xì)胞與細(xì)胞的接觸。這可以通過(guò)將低密度的細(xì)胞電鍍到涂層表面來(lái)實(shí)現(xiàn)的。選擇用于涂覆表面的分子取決于研究參數(shù)，就像體遷移研究一樣。由于細(xì)胞傾向于粘附，因此必須進(jìn)行徹底的篩選過(guò)程，以確保選定的遷移細(xì)胞具有相關(guān)且具有代表性的表型。

圖 2. FRET 生物傳感器通過(guò)將供體和受體熒光團(tuán)連接到感興趣的分子來(lái)發(fā)揮作用。當(dāng)分子相互作用并且供體足夠接近以激發(fā)受體熒光團(tuán)時(shí)，就會(huì)發(fā)生 FRET。這導(dǎo)致強(qiáng)度信號(hào)從完全供體轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆荏w。

單細(xì)胞技術(shù)中的3D 遷移是一種較容易采用的技術(shù)，因?yàn)樗Y(jié)合了單細(xì)胞分析的特點(diǎn)，同時(shí)將細(xì)胞置于與其原生環(huán)境非常相似的環(huán)境中。膠原蛋白 3D 基質(zhì)現(xiàn)在可以在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中輕松生產(chǎn)，這使得這些研究比以前在基質(zhì)凝膠上進(jìn)行的研究較容易獲得。盡管 2D 和 3D 遷移之間的運(yùn)動(dòng)有相似之處，但正在生成更全面的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)圖像。細(xì)胞通過(guò)肌動(dòng)蛋白聚合在 2D 中遷移，從而產(chǎn)生具有片狀偽足的前沿和滯后邊緣。然而，在 3D 中，有幾種遷移模式取決于前緣形狀和細(xì)胞-基質(zhì)粘附。此外，即使在 3D 中，細(xì)胞也會(huì)繼續(xù)對(duì)基質(zhì)的機(jī)械特性做出反應(yīng)。2D 和 3D 遷移之間有明顯的相似之處，但環(huán)境更加復(fù)雜和動(dòng)態(tài)，導(dǎo)致遷移趨勢(shì)多種多樣。3D 遷移的比較大的挑戰(zhàn)之一是使用顯微鏡可視化該過(guò)程以收集相關(guān)數(shù)據(jù)，但先進(jìn)的成像技術(shù)和計(jì)算機(jī)算法使其成為可能。

圖 3.細(xì)胞牽引力通過(guò)細(xì)胞附著和變形支柱 (A) 或 Fn 涂層水凝膠 (B) 來(lái)計(jì)算。

生化活性測(cè)定

在單細(xì)胞技術(shù)水平研究生物過(guò)程可以擴(kuò)展許多以前的知識(shí)庫(kù)，方法是識(shí)別通常通過(guò)分析大量大細(xì)胞群而模糊的關(guān)鍵差異。然而，單細(xì)胞技術(shù)也適用于研究導(dǎo)致和驅(qū)動(dòng)這些過(guò)程的根生化活動(dòng)。Forester 或熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 是能量從供體到受體熒光團(tuán)的無(wú)輻射轉(zhuǎn)移 。轉(zhuǎn)移依賴于鄰近性，并且僅當(dāng)兩個(gè)相應(yīng)的熒光團(tuán)相距 1 到 10 納米時(shí)才會(huì)發(fā)生。在這些距離內(nèi)，激發(fā)（供體）熒光團(tuán)發(fā)射一個(gè)虛擬質(zhì)子，該質(zhì)子被接收（受體）熒光團(tuán)吸收，引起相應(yīng)的激發(fā)。因此，結(jié)果被解釋為受體熒光的函數(shù)（圖 2）。FRET 允許對(duì)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)顯微鏡分辨率的生物現(xiàn)象進(jìn)行可視化 。多種分子可以與供體和受體熒光團(tuán)結(jié)合，使 FRET 能夠探測(cè)許多生物過(guò)程。FRET 已成功用于探測(cè)蛋白質(zhì)折疊和構(gòu)象、DNA-DNA/RNA 相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和配體-受體結(jié)合 。FRET 系統(tǒng)通常被稱為生物傳感器，除了能夠獨(dú)立生產(chǎn)新的傳感器之外，現(xiàn)在還可以直接通過(guò)商業(yè)的方式獲得。

生物傳感器用于較多地了解 GTP 酶的作用。使用多個(gè) FRET 傳感器產(chǎn)生了傳統(tǒng)生化方法無(wú)法獲得的時(shí)空 GTPase 活性數(shù)據(jù)。通過(guò)這些信息可以了解遷移以及與 GTPase Rho、Rac 和 Cyc42 的關(guān)系。已確定 Rac 對(duì)細(xì)胞遷移初始階段前沿的細(xì)胞伸長(zhǎng)比較重要，而 Rho 和 Cyc42 對(duì)滯后端的回縮也重要。

細(xì)胞牽引力的測(cè)定

細(xì)胞牽引力 (CTF) 是許多生物過(guò)程（如遷移）的驅(qū)動(dòng)力。作為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)劑，它們?cè)谘苌珊脱馨l(fā)生、發(fā)育、傷口愈合和疾病進(jìn)展等動(dòng)態(tài)過(guò)程中有著重要作用。細(xì)胞產(chǎn)生的機(jī)械力也有助于通過(guò)涉及機(jī)械信號(hào)的反饋回路調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀和體內(nèi)平衡。細(xì)胞通過(guò)附著點(diǎn)產(chǎn)生牽引力到稱為粘著斑的細(xì)胞外基質(zhì)。當(dāng)施加力時(shí)，它會(huì)導(dǎo)致 ECM 發(fā)生變化，通過(guò)這種粘附感測(cè)到，并導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的變化。細(xì)胞也可以通過(guò)這些力相互作用。

CTF 的測(cè)量需要三個(gè)步驟：打印力陣列、零力陣列測(cè)量和施力陣列測(cè)量。CTF 測(cè)量的主要方法是將小柱打印到柔性聚丙烯酰胺凝膠 (PG) 上，并用細(xì)胞外基質(zhì)蛋白涂覆它們以形成粘著斑 (圖 3A)。這些支柱起到懸臂的作用，變形或彎曲它們所需的力可以通過(guò)支柱的已知物理特征來(lái)計(jì)算。支柱的參數(shù)和它們印刷的圖案是根據(jù)相關(guān)應(yīng)用確定的。參數(shù)的變化已被用于確定粘著斑數(shù)量對(duì) CTF的影響。

細(xì)胞外基質(zhì)蛋白可以直接打印到靈活的 PG 表面（圖 3B）。與柱子一樣控制間距和圖案。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是可以以不同的分布和模式打印多種蛋白質(zhì)，以探索基于粘附基材的 CTF 的差異。這種方法已經(jīng)證明，細(xì)胞遷移與 Fn 形成粘著斑，而不是白蛋白或?qū)诱尺B蛋白。此外，這項(xiàng)技術(shù)還提供了 CTF 的實(shí)時(shí)分析，并可以同時(shí)確定電池的機(jī)械性能。

CTF 提供了對(duì)粘附和遷移過(guò)程的機(jī)械洞察。內(nèi)皮細(xì)胞 CTF 的研究證實(shí)了細(xì)胞遷移的滯后模型，并且還表明細(xì)胞運(yùn)動(dòng)取決于細(xì)胞附著點(diǎn)的密度。形態(tài)也受到細(xì)胞粘附和 CTF 的影響，導(dǎo)致細(xì)胞呈現(xiàn)出與粘著斑數(shù)相關(guān)的不同表型。對(duì)細(xì)胞遷移機(jī)制的透徹理解主要應(yīng)用于傷口愈合、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞發(fā)育研究中。

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