細(xì)胞外囊泡簡(jiǎn)稱“EV”,它的分子構(gòu)成較為復(fù)雜，主要包括表面受體、膜和可溶性蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、基因組 DNA 和異質(zhì)范圍的 RNA，包括 mRNA、microRNA、tRNA、rRNA、小核仁 RNA、小環(huán)狀核仁 RNA、piRNA、scaRNA、病毒 RNA、Y RNA和長(zhǎng)鏈非編碼 RNA等。目前，在細(xì)胞外囊泡的分離和表征、細(xì)胞外泌體中microRNA圖譜等方面已有深入的研究， 其中研究細(xì)胞外囊泡EV 的 microRNA 圖譜的方法包括 qRT-PCR、高通量測(cè)序和 microRNA 微陣列等。

一、細(xì)胞外囊泡分離步驟

   根據(jù)供應(yīng)商提供的說明，可使用來自血清或細(xì)胞培養(yǎng)基 (ThermoFisher) 的總外泌體分離試劑從 1 至 3 ml 血清或 2 ml 組織培養(yǎng)上清液中通過沉淀從血清或細(xì)胞條件培養(yǎng)基中分離出細(xì)胞外囊泡。立即處理產(chǎn)生的 EV 顆粒以進(jìn)行 EV 表征或下游 RNA 分離。然后通過差速超速離心 (UC) 從細(xì)胞條件培養(yǎng)基制備 EV . 簡(jiǎn)而言之，將條件培養(yǎng)基在 4°C 下以 400 × g 離心 5 分鐘以排除分離的細(xì)胞和碎片，然后在 4°C 下以 2000 × g 離心 20 分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至離心管（耐思nest）并以 10,000×g 離心 45 分鐘，然后在 Beckman L8-80 超速離心機(jī)中離心。EV 顆粒在 60 ml  PBS 中洗滌，在 4°C 下以 100,000 × g 再次離心 90 分鐘，然后重新懸浮在 > 100 μl 無(wú)菌無(wú)顆粒 PBS (Gibco) 中并儲(chǔ)存在 -80°C 用于下游EV 表征或 RNA 分離。

二、細(xì)胞外囊泡表征

1.透射電鏡觀察

使用 Pioloform? (SPI Supplies) 拍攝的 300 目網(wǎng)格（Gilder 網(wǎng)格）進(jìn)行透射電子顯微鏡 (TEM)，這些網(wǎng)格在使用前經(jīng)過碳涂層和等離子蝕刻。將每個(gè) EV 顆粒重新懸浮在 100 μl 磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 中，每個(gè)網(wǎng)格拾取 10 μl 液滴，孵育 5 秒并去除多余的樣品。網(wǎng)格用醋酸雙氧鈾 (Agar Scientific) 染色，風(fēng)干并使用 Hitachi HT7800 透射電子顯微鏡檢查。

2.納米粒子追蹤分析

      使用配備有 NTA 軟件 v2.3（NanoSight Ltd）的 NanoSight LM10-HS 顯微鏡（Malvern Panalytical Ltd）進(jìn)行納米粒子跟蹤分（NTA）。每個(gè)樣品記錄三個(gè) 60 秒的記錄，在無(wú)菌過濾的 PBS (Sigma) 中以 1:10,000 稀釋。使用高分辨率納米單顆粒分析儀 Nanocoulter Ⅰ進(jìn)行顆粒粒徑、濃度、zeta電位、形態(tài)多維度檢測(cè)。

    (a) EV 標(biāo)記 CD63、CD81 和 CD9 的陽(yáng)性染色以及適當(dāng)?shù)耐N型對(duì)照，使用從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離的 EV 通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行評(píng)估。 

    (b) 透射電子顯微鏡顯示預(yù)期大小范圍（30-200 nm）和形態(tài)（杯形囊泡）的分離血清 EV。(c) 陽(yáng)性 EV 標(biāo)記 Flotillin-1 和 Alix 表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析。

    (d) 基于 NanoSight 的納米粒子跟蹤分析，表明 EV 尺寸分布在預(yù)期范圍內(nèi)（模式 105.4 nm）。

    (e) 使用生物分析儀 (179 pg/ul) 評(píng)估從 EV 中分離的 RNA 濃度。

3.流式細(xì)胞術(shù)

     對(duì)于 EV 表面標(biāo)記 CD64、CD9 和 CD81 的流式細(xì)胞術(shù) (FC) 評(píng)估，使用轉(zhuǎn)輪在室溫下過夜孵育，將 EV 包被到 4 μm 醛/硫酸鹽乳膠珠 (ThermoFisher) 上。然后在室溫下用 1 M 甘氨酸 (Sigma) 封閉游離反應(yīng)位點(diǎn) 30 分鐘。珠子在 PBS + 0.5% 胎牛血清 (FCS) 溶液 (Invitrogen) 中洗滌 3 次，在 4°C 下與抗人 PE CD63 (H5C6)、PerCPCy5.5 CD9 (M-L13) 孵育 2 小時(shí)和 APC CD81 (JS-81) 抗體或相應(yīng)的同種型對(duì)照（全部來自 BD Biosciences），然后最后一次清洗。使用細(xì)胞成像分析儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集分析。

4.蛋白免疫印跡分析

      Alix 和 Flotillin-1 的蛋白質(zhì)印跡 (WB) 主要通過使用 2% 十二烷基硫酸鈉 (SDS) 和手動(dòng)剪切（1 毫升注射器和 0.8 × 38 毫米 21G 針頭 (Terumo)）裂解 EV 進(jìn)行。按照制造商的說明，使用 Micro BCA? 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒 (ThermoFisher) 確定蛋白質(zhì)定量。使用波長(zhǎng)為 575 nm 的酶標(biāo)儀來測(cè)量吸光度值。蛋白質(zhì)裂解物在含有 0.2% 溴酚 (Fisher Scientific) 和 50 μl/ml β-巰基乙醇 (Sigma) 的 Laemmli 緩沖液中稀釋，并在加載到 4%–20% Mini-PROTEAN? TGX? Precast 之前加熱至 95°C凝膠 (Bio-Rad Laboratories) 以及對(duì)照品和分子 Precision Plus Protein? 雙色標(biāo)準(zhǔn)品 (Bio-Rad Laboratories)。通過電印跡實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上。用攪拌和封閉緩沖液（PBS + 0.1% Tween 20、5% 脫脂牛奶和 5% BSA）封閉印跡。將印跡與 1:1000 一抗和 5 ml PBS-Tween 20 (PBS-T) 以及 5% 脫脂牛奶和 0.5% BSA 一起孵育。使用 1:1500（多克隆山羊抗小鼠，Daco）和 PBS-T 應(yīng)用二級(jí)抗體。使用透明試劑 (Bio-Rad)、LI-COR Odyssey FC 成像系統(tǒng)和 Image Studio 軟件 (LI-COR) 在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)下使印跡可視化。

5.RNA分離與濃縮

使用總外泌體和蛋白質(zhì)分離試劑盒 (Invitrogen) 從 EV 中分離出總 RNA。使用 NanoString Technologies 批準(zhǔn)的離心方案將 RNA 濃縮至 25 μl，并使用上樣體積0.5ML的超濾管（默克密理博）進(jìn)行離心過濾。使用生物分析儀和 RNA 6000 Pico 試劑盒對(duì)采集的 RNA 進(jìn)行定量分析。

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