[實驗原理]

  當(dāng)細(xì)胞置于非常高的電場中，細(xì)胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴散進細(xì)胞內(nèi)，這一現(xiàn)象稱為電穿孔。運用這一技術(shù)，許多物質(zhì)，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、藥物、抗體和熒光探針都能載入細(xì)胞。作為一種基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，電穿孔已被廣泛用于各種細(xì)胞類型，包括細(xì)菌、酵母、植物和動物細(xì)胞；而且，它還能作為注射方法（稱為電注射），把各種外源物質(zhì)引入活細(xì)胞。

與其他常用的導(dǎo)入外源物質(zhì)的方法相比，電穿孔具有很多優(yōu)點。

1.不必象顯微鏡那樣使用玻璃針，不需要技術(shù)培訓(xùn)和昂貴的設(shè)備，可以一次對成百萬的細(xì)胞進行注射。

2.與用化學(xué)物質(zhì)相比，電穿孔幾乎沒有生物或化學(xué)副作用。

3.因為電穿孔是一種物理方法，較少依賴細(xì)胞類型，因而應(yīng)用廣泛。實際上，對大多數(shù)細(xì)胞類型，用電穿孔法基因的轉(zhuǎn)移效率比化學(xué)方法高得多。

   除了能使細(xì)胞膜具有通透性，讓外界的分子擴散入胞液中以外，高強度的電場脈沖也能引起細(xì)胞融合，這一現(xiàn)象叫做電融合。然而，在用電脈沖融合前必須使細(xì)胞相互緊密接觸，這一電融合方法在原生質(zhì)融合制取雜交植物，胚胎細(xì)胞相互融合制備動物克隆方面非常有用，尤其在制取雜交瘤細(xì)胞制備單克隆抗體方面用處很大。幾個實驗室已證明使用電場電融合效率比常規(guī)的化學(xué)融合方法高10到100倍，最近，貼壁細(xì)胞的電融合還被用來研究細(xì)胞融合時細(xì)胞的骨架成分和細(xì)胞器的動力學(xué)重排。
[儀器、材料和試劑]
（一）儀器：
脈沖發(fā)生器，樣品池：一個盛細(xì)胞的容器和兩個平行的金屬電極，CO2培養(yǎng)箱，離心機，顯微鏡，微量移液器，鑷子，剪刀，三角瓶，吸管，毛細(xì)管，離心管等。
（二）材料：
（三）試劑：
穿孔介質(zhì)（PM）：15mmol/L磷酸鉀　1mmol/L MgCl2 250mmol/L蔗糖（或甘露醇）　10mmol/L HEPES　調(diào)節(jié)pH至7.3

融合介質(zhì)（FM）：1mmol/L MgCl2 280mmol/L甘露醇　2mmol/L HEPES　調(diào)節(jié)pH至7.3。

[方法與步驟]

一．懸浮細(xì)胞的電穿孔法：

電穿孔進行基因轉(zhuǎn)移

電穿孔可用于將多種不同類型的分子載入活細(xì)胞中，操作步驟非常相似。以下我們用基因轉(zhuǎn)移作為例子。載入其他的分子可按以下相同步驟進行，只需把外源DNA換頁所需分子即可。
1.1　使細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)基中生長，用胰酶處理，收獲對數(shù)生長中期的細(xì)胞，并用腺酶處理。
1.2　在穿孔介質(zhì)（PM）中至少洗一次。洗細(xì)胞時，在臺式離心機上1000rpm離心3分鐘，使得懸浮細(xì)胞沉降。然后，去掉上清液，在新的介質(zhì)中重新懸浮細(xì)胞。
1.3　計數(shù)細(xì)胞，在PM中，濃縮細(xì)胞為大約1千萬細(xì)胞/ml。
1.4　將DNA加到細(xì)胞懸液中，充分混合，使DNA均勻分散，用吸管吸一定體積的細(xì)胞-DNA混合液到裝有電極的滅菌小樣品池中。
1.5　在電穿孔裝置上設(shè)置輸出電壓和脈沖寬度（脈沖寬度是指數(shù)衰減函數(shù)的時間常數(shù)，即τ=RC，C是電容，R是樣品的電阻）。假如設(shè)備是CD脈沖型發(fā)生器，設(shè)定電容和并聯(lián)電阻，以達(dá)到合適的τ值。
1.6　將小池放進盛樣品的池中，啟動電穿孔裝置，供給所需的電脈沖。
1.7　電處理后，向小池加1ml普通培養(yǎng)基，將細(xì)胞混合液從小池轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)容器（培養(yǎng)皿或培養(yǎng)孔）中，再加入一些培養(yǎng)基使最終的培養(yǎng)基體積適量。然后，將樣品細(xì)胞放回孵育箱中使之在正常條件下生長。
1.8　在測定轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)量前電穿孔細(xì)胞各自培養(yǎng)的時間不同。
2檢測電穿孔效率和細(xì)胞存活率
2.1 除用羅丹明偶聯(lián)葡聚糖（1mg/ml）（分子探針）代替DNA外，將羅丹明偶聯(lián)葡聚糖引入目標(biāo)細(xì)胞的方法如前所述。
2.2 電穿孔后，用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，去掉胞外的熒光葡聚糖。
2.3 電穿孔后30min，向細(xì)胞懸液中加30μl臺盼藍(lán)，孵育2min，然后用培養(yǎng)基洗滌。
2.4 在1000rpm下離心3min，收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于PM中，終體積100μl。
2.5 將一滴細(xì)胞液（30μl）置于干凈載玻片上，用蓋玻片蓋好，在顯微鏡下檢測細(xì)胞，測定攝取熒光標(biāo)記葡聚糖的百分?jǐn)?shù)。
2.6 在亮視野鏡片下，死細(xì)胞可因染成藍(lán)色檢測出（攝取了臺盼藍(lán)），測定細(xì)胞存活的百分?jǐn)?shù)。
2.7 在各種電場設(shè)定值下重復(fù)實驗，畫出攝取葡聚糖率和細(xì)胞存活率對電穿孔參數(shù)的曲線。這一曲線就將顯示對特定細(xì)胞類型電穿孔的合適條件。