聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) 技術(shù)是無(wú)數(shù)研究和測(cè)試實(shí)驗(yàn)室的主要技術(shù)，涉及的領(lǐng)域包括生物醫(yī)學(xué)、基因編輯、食品微生物學(xué)測(cè)試 等。熒光定量PCR技術(shù)使用熱循環(huán)來(lái)促進(jìn)一系列反應(yīng)，在這些反應(yīng)中，DNA 樣本會(huì)快速、呈指數(shù)地復(fù)制，從而產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)或數(shù)十億個(gè)序列拷貝。購(gòu)買(mǎi)PCR儀器時(shí)，重要的是要考慮您的應(yīng)用的最終目標(biāo)、熱循環(huán)設(shè)備的準(zhǔn)確性和效率以及儀器的容量和靈活性。本文概述了 PCR儀器可用的不同選項(xiàng)和功能，以幫助您選購(gòu)合適的PCR儀 。

1. PCR 與 qPCR 與 dPCR

雖然所有 PCR 系統(tǒng)都使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)復(fù)制 DNA，但不同的系統(tǒng)使用不同的方法來(lái)獲得特定的結(jié)果。這些不同的方法包括標(biāo)準(zhǔn) PCR、定量 PCR (qPCR) 和數(shù)字 PCR (dPCR)。

標(biāo)準(zhǔn) PCR 儀器通常用于擴(kuò)增 DNA 以供進(jìn)一步下游測(cè)試和使用；從某種意義上說(shuō)，這項(xiàng)技術(shù)被用作生成產(chǎn)品的一種手段，而不是作為一種分析測(cè)試方法本身。擴(kuò)增的 DNA 只能在 PCR 反應(yīng)完成后進(jìn)行測(cè)量，而不是實(shí)時(shí)測(cè)量，因此這種方法有時(shí)被稱(chēng)為終點(diǎn) PCR。傳統(tǒng) PCR 擴(kuò)增的最終產(chǎn)物通常用于下游克隆和測(cè)序，也可以使用凝膠電泳進(jìn)行檢查，以在低分辨率（基于條帶強(qiáng)度）下確認(rèn)目標(biāo)序列的存在及其相對(duì)數(shù)量。

為了更快速、更準(zhǔn)確地定量樣品中存在的目標(biāo)序列的數(shù)量，定量 PCR (qPCR)，也稱(chēng)為實(shí)時(shí) PCR，在擴(kuò)增過(guò)程中使用熒光探針來(lái)監(jiān)測(cè)每個(gè)熱循環(huán)后存在的 DNA 數(shù)量。通過(guò)觀察需要多少個(gè)循環(huán)才能達(dá)到特定的熒光強(qiáng)度閾值，分析人員可以在將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較時(shí)確定起始材料中的 DNA 量。 qPCR 還可以比普通 PCR 更快地確認(rèn)目標(biāo)序列的存在或不存在，例如 SARS-CoV-2 的檢測(cè)（使用逆轉(zhuǎn)錄首先將病毒 RNA 轉(zhuǎn)化為 cDNA） .

數(shù)字 PCR (dPCR) 是另一種定量方法，其中 PCR 反應(yīng)在數(shù)千個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)室中進(jìn)行，原始樣品中 DNA 分子的絕對(duì)數(shù)量可以根據(jù)擴(kuò)增完成后有多少反應(yīng)室產(chǎn)生熒光信號(hào)來(lái)確定. 與 qPCR 不同，熒光測(cè)量不是實(shí)時(shí)進(jìn)行的，也不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)量化樣品中的 DNA。雖然 dPCR 通常具有有限的通量和比 qPCR 更高的成本，但它在量化 DNA 方面更加精確、靈敏和準(zhǔn)確，并且在檢測(cè)罕見(jiàn)突變和單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 等應(yīng)用中較有用。

當(dāng)您考慮您的應(yīng)用時(shí)，決定是選擇終點(diǎn)（定性/半定量）PCR 還是定量（qPCR 或 dPCR）方法相對(duì)簡(jiǎn)單，但 qPCR 和 dPCR 之間的選擇可能更加微妙。qPCR 具有高通量、經(jīng)濟(jì)高效且對(duì)許多應(yīng)用足夠靈敏，但如果具有低檢測(cè)限的絕對(duì)量化至關(guān)重要，則 dPCR 可能是更好的選擇。

2.溫度控制的重要性

熱循環(huán)儀準(zhǔn)確有效地調(diào)節(jié)和控制樣品溫度的能力是擴(kuò)增反應(yīng)成功的關(guān)鍵，應(yīng)該成為選擇任何 PCR 系統(tǒng)的重點(diǎn)。不同的系統(tǒng)可能在升溫速率、溫度均勻性和準(zhǔn)確性以及跨熱塊實(shí)現(xiàn)溫度梯度以幫助 PCR 方法優(yōu)化的能力方面提供不同的能力。

升溫速率是指熱循環(huán)步驟之間溫度變化的速度，在儀器規(guī)格中通常表示為每秒攝氏度 (°C/sec)。制造商可能會(huì)提供有關(guān)最大斜率和平均斜率的信息，并區(qū)分儀器的上升斜率（加熱）和下降斜率（冷卻）。

一般來(lái)說(shuō)，更高的斜坡率對(duì)應(yīng)于更快的運(yùn)行時(shí)間，但購(gòu)買(mǎi)者應(yīng)注意不要只關(guān)注MAX斜坡率而不檢查與儀器速度相關(guān)的其他指標(biāo)。儀器可能只會(huì)在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到其較高升溫速率，而平均升溫速率將更好地反映溫度變化的速度。雖然升溫速率規(guī)格可能給出某些儀器可以運(yùn)行多快的一般概念，但在可能的情況下，尋找儀器上展示的實(shí)際運(yùn)行時(shí)間的數(shù)據(jù)，以真實(shí)地了解高升溫速率如何轉(zhuǎn)化為快速分析。朗基T30 PCR儀的升溫速度甚至可以達(dá)到7.5℃/sec。

溫度的準(zhǔn)確性和均勻性也是成功反應(yīng)的關(guān)鍵，雖然所有熱循環(huán)儀的設(shè)計(jì)都是為了產(chǎn)生 PCR 所需的溫度，但某些功能可以提供更高的置信度，這對(duì)于樣品可能有限且結(jié)果可靠的應(yīng)用至關(guān)重要。當(dāng)使用PCR儀器進(jìn)行高分辨率熔解 (HRM) 分析等敏感技術(shù)時(shí)，精確的溫度控制也至關(guān)重要。

加熱的蓋子可以確保整個(gè) PCR 管更好的溫度均勻性，因?yàn)闆](méi)有加熱的蓋子，樣品會(huì)蒸發(fā)并凝結(jié)到溫度較低的管頂部。熱塊設(shè)計(jì)也會(huì)影響溫度控制；鋁塊導(dǎo)電性低，這意味著它們將比更導(dǎo)電的塊更慢地實(shí)現(xiàn)溫度均勻性并且具有更低的升溫速率。鍍銀和鍍金的模塊雖然昂貴，但可以更快地進(jìn)行熱傳遞，從而確保整個(gè)塊的溫度分布均勻。

不同的 DNA 目標(biāo)可能需要不同的溫度才能獲得較好的擴(kuò)增結(jié)果；例如，富含 GC 的序列需要更高的溫度才能變性。理想的退火溫度也受到一系列因素的影響——而該步驟的溫度通常是根據(jù)引物的解鏈溫度、引物對(duì)之間解鏈溫度的差異以及試劑濃度、pH 和鹽濃度的影響來(lái)選擇的。使優(yōu)化反應(yīng)溫度條件成為一項(xiàng)復(fù)雜的任務(wù)。

具有溫度梯度能力的 PCR 儀器旨在通過(guò)允許在單次運(yùn)行中測(cè)試多個(gè)退火溫度來(lái)幫助優(yōu)化 PCR 方法。根據(jù)您計(jì)劃使用 PCR 儀器分析的樣品類(lèi)型和多樣性，帶梯度功能的PCR儀器雖然價(jià)格稍高于普通PCR儀，但對(duì)工作效率提升不少。比如：朗基系列的 A600系列。

3.加熱模塊

如前所述，與 PCR 儀器一起使用的加熱塊可以在溫度控制方面產(chǎn)生差異，但加熱塊的設(shè)計(jì)——以及儀器適應(yīng)不同加熱塊的設(shè)計(jì)——也會(huì)影響通量、耗材成本和靈活性。典型的塊將采用 96 孔或 384 孔格式，但也可提供其他格式，如 48 孔和 1536 孔?？讛?shù)越高，反應(yīng)體積越小，吞吐量越高，最初成本更高，但由于每個(gè)孔使用的試劑量較少，最終會(huì)降低每次反應(yīng)的價(jià)格。選擇時(shí)需要考慮您要處理的樣品數(shù)量以及您使用儀器的頻率。

一些PCR儀器帶有固定模塊，而其他儀器允許使用可互換塊，從而提供較大的靈活性，可以在 96 孔和 384 孔格式之間或在不同應(yīng)用的不同塊材料之間切換。一些熱循環(huán)儀還在同一臺(tái)儀器中容納多個(gè)模塊，使不同的協(xié)議能夠同時(shí)在不同的樣本集上運(yùn)行。比如：朗基的 Q2000B熒光定量PCR儀同時(shí)用擁有4通道檢測(cè)，適用低位的PCR管、8聯(lián)排管或96孔板。

由于此組件在溫度控制、樣品處理和通量方面的關(guān)鍵作用，因此在選擇熱循環(huán)儀時(shí)應(yīng)仔細(xì)考慮熱塊選項(xiàng)。對(duì)于樣品量較少的實(shí)驗(yàn)室，或者那些通常只進(jìn)行少量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室，具有標(biāo)準(zhǔn) 96 孔的低成本固定塊儀器可能就足夠了。然而，模塊化、靈活的儀器可能有利于具有更多協(xié)議、不同樣本量和更多用戶依賴同一儀器進(jìn)行自己的分析的實(shí)驗(yàn)室，以及可能希望在未來(lái)擴(kuò)大其通量能力的實(shí)驗(yàn)室。

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