Real-time PCR 是一種強(qiáng)大的分子生物學(xué)技術(shù)，可用于各種領(lǐng)域，可以實(shí)時(shí)定量和擴(kuò)增特定核酸序列。TaqMan 檢測(cè)是一種流行的實(shí)時(shí) PCR 方法，它使用熒光探針檢測(cè)和量化僅包含少量拷貝的樣本中的 DNA 或 RNA 靶標(biāo)，使其在從臨床診斷到基因研究的應(yīng)用中具有重要價(jià)值。 PCR 反應(yīng)依賴(lài)于專(zhuān)為與目標(biāo)序列特異性雜交而設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針，由分別位于 5' 和 3' 端的熒光報(bào)告染料和淬滅染料組成。目標(biāo)序列側(cè)翼的引物作為 Taq 聚合酶合成模板的起點(diǎn)。

在 PCR 反應(yīng)過(guò)程中，當(dāng)探針在擴(kuò)增過(guò)程中被 Taq 聚合酶切割時(shí)，會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，實(shí)時(shí)測(cè)量產(chǎn)生的熒光，并與樣品中目標(biāo) DNA 或 RNA 的量成正比。反應(yīng)中存在的目標(biāo)序列拷貝數(shù)越多，被切割的 TaqMan 探針就越多，從而產(chǎn)生更高的熒光信號(hào)。TaqMan 檢測(cè)的關(guān)鍵步驟如下所示，其中核酸模板變性，TaqMan 探針和引物退火并用 Taq 聚合酶延伸，然后切割 TaqMan 探針，檢測(cè)熒光信號(hào)，擴(kuò)增靶標(biāo)在多個(gè)周期序列。

定量實(shí)時(shí) PCR 的優(yōu)勢(shì)

與傳統(tǒng) PCR 技術(shù)相比，實(shí)時(shí) PCR 具有許多優(yōu)勢(shì)，包括更高的靈敏度、更高的特異性和快速的結(jié)果，因?yàn)檎麄€(gè)測(cè)定在單個(gè)反應(yīng)中完成。該方法也更省時(shí)、更省力，并且由于不需要擴(kuò)增后程序，還減少了污染的機(jī)會(huì)。

適合實(shí)時(shí)熒光定量 PCR具有檢測(cè)和量化豐度極低的 DNA 或 RNA 靶標(biāo)的靈敏度，并且由于探針是針對(duì)特定靶序列設(shè)計(jì)的，因此實(shí)現(xiàn)了更高的特異性，與傳統(tǒng)方法相比，可最大限度地減少假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生聚合酶鏈反應(yīng)。然而，該檢測(cè)的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是針對(duì)目標(biāo)序列設(shè)計(jì) TaqMan 引物和探針。這可能是一項(xiàng)復(fù)雜且具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，需要深入了解目標(biāo)序列和探針設(shè)計(jì)原則。

設(shè)計(jì) TaqMan 引物和探針的挑戰(zhàn)

為實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (實(shí)時(shí) PCR TaqMan )設(shè)計(jì)引物和探針的主要挑戰(zhàn)之一是確保序列特異性。引物和探針必須設(shè)計(jì)為以高特異性靶向所需序列，以避免與非目標(biāo)序列結(jié)合，這可能導(dǎo)致假陽(yáng)性或測(cè)量不準(zhǔn)確。

另一個(gè)挑戰(zhàn)是優(yōu)化引物和/或探針解鏈溫度 (Tm)，在該溫度下引物在 PCR 擴(kuò)增期間與目標(biāo)序列退火。不是實(shí)時(shí) PCR 反應(yīng)的最佳選擇。退火溫度過(guò)低會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合，退火溫度過(guò)高則引物不能有效結(jié)合，導(dǎo)致擴(kuò)增效率低，靈敏度低。

引物和探針的長(zhǎng)度和 GC 含量等其他參數(shù)會(huì)影響其特異性和效率。太短或太長(zhǎng)的引物和探針可能無(wú)法有效結(jié)合目標(biāo)序列，而 GC 含量高的引物和探針可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合。此外，設(shè)計(jì)生成非常長(zhǎng)的擴(kuò)增子的引物可能會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率低下。

如果 TaqMan 探針不穩(wěn)定，它可能會(huì)降解并過(guò)早釋放熒光信號(hào)，從而導(dǎo)致誤報(bào)。所以，要考慮 PCR 擴(kuò)增過(guò)程中探針降解的可能性。避免這一情況的出現(xiàn)主要通過(guò)選擇具有穩(wěn)定熒光染料的探針或修改探針化學(xué)以增加穩(wěn)定性來(lái)減輕。

GenScript 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (TaqMan) 引物和探針工具

GenScript 提供了一個(gè)用戶(hù)友好的在線(xiàn)生物信息學(xué)工具，用于設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí) PCR 檢測(cè)的高度特異性和高效的引物和探針，可在 GenScript 網(wǎng)站上免費(fèi)獲得。它可以根據(jù)用戶(hù)提供的目標(biāo)序列自動(dòng)設(shè)計(jì) TaqMan 探針。

該工具利用先進(jìn)的算法來(lái)設(shè)計(jì) TaqMan 引物和探針，這些引物和探針考慮了幾個(gè)重要參數(shù)，包括特異性、解鏈溫度、GC 含量、自身互補(bǔ)性和交叉反應(yīng)性。用戶(hù)可以選擇感興趣的物種并輸入所需的目標(biāo)序列和參數(shù)，例如擴(kuò)增子大小、Tm 范圍和排除區(qū)域，該工具將生成滿(mǎn)足指定標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)化引物和探針。GenScript 實(shí)時(shí) PCR 引物和探針設(shè)計(jì)工具的輸出包括有關(guān)設(shè)計(jì)的引物和探針的詳細(xì)信息，例如它們的序列、解鏈溫度、GC 含量、擴(kuò)增子長(zhǎng)度以及發(fā)夾環(huán)或二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在，以確保設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性和特異性。

總體而言，GenScript Real-time PCR Primer and Probe Design Tool 是一款功能強(qiáng)大且用戶(hù)友好的在線(xiàn)工具，可以幫助研究人員設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí) PCR 實(shí)驗(yàn)的高質(zhì)量 TaqMan 引物和探針，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中節(jié)省時(shí)間和寶貴的資源.

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