丙酮酸羧化酶是細胞質(zhì)和線粒體代謝途徑的重要元素，可以有效促進能量代謝。在 CHO 細胞中過表達酵母胞質(zhì)丙酮酸羧化酶 (PYC2)，可 以增加丙酮酸流向 TCA 循環(huán)。增強的 PYC2 表達導致丙酮酸通量增加，從而使乳酸積累減少多達 4 倍，并顯著增加細胞密度和培養(yǎng)壽命。有了這個結(jié)果，與親本細胞相比，工程細胞的抗體表達顯著提高了 70%，產(chǎn)品質(zhì)量也有所提高（約 3 倍）。通過PYC2 工程改造提升細胞性能，在丙酮酸、葡萄糖、乳酸和細胞能量代謝方面具有均高于親代細胞的各種優(yōu)勢。

PYC2 工程改造原理和方法

在補料分批上游工藝中，產(chǎn)生抗體的 CHO 細胞需要持續(xù)提供碳、氮、能量 (ATP) 和還原劑 (NADPH) 以維持其合成代謝功能。 由于培養(yǎng)基消耗糖酵解過程會產(chǎn)生乳酸和氨等不需要的廢物，這些物質(zhì)積累，會阻礙細胞生長以及重組產(chǎn)品的產(chǎn)品質(zhì)量屬性。

糖酵解是葡萄糖被氧化的主要分解代謝途徑，最后，一分子葡萄糖轉(zhuǎn)化為兩分子丙酮酸，然后進入線粒體并在 TCA 循環(huán)中被氧化。CHO 細胞在補料分批模式下的細胞代謝需要高速率的糖酵解，從而觸發(fā)丙酮酸的積累。由于線粒體和胞質(zhì)代謝系統(tǒng)的連通性差，大部分積累的丙酮酸通量驅(qū)動乳酸脫氫酶 (LDH) 產(chǎn)生乳酸. 乳酸的測定一般使用EKF Biosen C-Line 來進行葡萄糖乳酸分析。

迄今為止，已經(jīng)嘗試了多種方法來使用生產(chǎn)宿主的代謝工程或細胞培養(yǎng)過程的過程工程來減少細胞培養(yǎng)廢物。比如使用半乳糖或丙酮酸替代葡萄糖，或用天冬酰胺或谷氨酸替代谷氨酰胺。調(diào)節(jié)細胞系統(tǒng)代謝途徑中涉及的酶來減少廢物積累也是一種不錯的選擇。

PYC2 工程改造是通過在哺乳動物細胞 BHK 和 HEK293 細胞中表達胞質(zhì)酵母丙酮酸羧化酶 2 (PYC2) 基因來減少乳酸積累，從而增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量或改善細胞生長， 實驗證明，在 CHO 細胞中過表達 PYC2 可以延長細胞培養(yǎng)時間，并將乳酸/葡萄糖比率降低 25%，但是，比生產(chǎn)率降低 50%，從而影響整體體積抗體表達。主要方法是通過 PYC2 改造的細胞庫的異源群體中篩選 PYC2 改造的 CHO 克隆。隨后，根據(jù)培養(yǎng)性能及其代謝特征從 PYC2 克隆組中選擇單細胞克隆。基于各種生化和代謝分析，建立了一個代謝控制的 CHO 平臺，該平臺具有增強的 PYC2 基因負載，并且能夠在較高的細胞密度、高葡萄糖消耗率和降低的乳酸的分批補料過程中維持較長時間積累。

PYC2 工程的細胞庫生成和細胞系開發(fā)

   為了增強細胞代謝并改善細胞溶質(zhì)和線粒體代謝途徑，我們通過增加 CHO 細胞池中的 PYC2 基因負荷來改造 CHO 細胞系統(tǒng)。在這項研究中，我們使用密碼子優(yōu)化（針對 CHO）酵母丙酮酸羧化酶 (PYC2) 基因，該基因在 CHO 細胞的胞質(zhì)溶膠中表達。PYC2 通過將細胞溶質(zhì)丙酮酸驅(qū)向代謝途徑的克雷伯循環(huán)，在控制丙酮酸積累方面發(fā)揮關鍵作用”。增加表達代謝優(yōu)化 PYC2 基因的基因拷貝可有效觸發(fā)丙酮酸流向線粒體代謝途徑，并將糖酵解與 TCA 循環(huán)聯(lián)系起來，以增強內(nèi)部細胞能量代謝。 

    通過使用氖電穿孔法，用帶有 PYC2 基因的質(zhì)粒 pMPYC 轉(zhuǎn)染 CHO-S 細胞（懸浮液），并產(chǎn)生穩(wěn)定的細胞庫。為了從轉(zhuǎn)染池中篩選出所需的 CHO 克隆，我們應用了兩階段選擇方案，其中我們使用不同濃度的選擇劑嘌呤霉素和 MTX 生成了轉(zhuǎn)染的 CHO 細胞群. 選擇壓力從低濃度逐漸增加到高濃度，通過消除源自高度異質(zhì)性群體的不良細胞/克隆，可以嚴格選擇所需的細胞庫。選定的池具有混合的轉(zhuǎn)染 PYC2-CHO 細胞群，這些細胞含有不同的 PYC2 基因拷貝，并且還由于隨機整合事件以及 CHO 基因組中的位置效應而改變 PYC2 表達模式。為了評估每個池的代謝性能，我們進一步選擇了池 1B、1C 和 2D 來評估 PYC2 表達效率，隨后使用 CD-Forti-CHO 基礎培養(yǎng)基和nest搖瓶進行了補料分批培養(yǎng)實驗。實驗中評估了代謝特征（乳酸和葡萄糖），細胞活力和生長模式從細胞周期的指數(shù)期到穩(wěn)定期，并將幾個重要參數(shù)與親代 CHO 細胞（未轉(zhuǎn)染）進行了比較。

實驗結(jié)論

    通過觀察，pool 1B（選自 Phase I，含有 200nM MTX 和 20ug/ml Puromycin），pool 1C（選自 phase II，含有 500nM MTX 和 30ug/ml Puromycin）和 pool 2D（選自 phase II，含有1000nM MTX 和 50ug/ml Puromycin）在細胞活力和細胞密度分布方面顯示出它們之間以及與親代 CHO 細胞的顯著差異。在池 1B 中，達到的峰值細胞密度高達 2000 萬個細胞/mL，但是，細胞活力從第 10 天開始下降，并在第 14 天達到約 72%，而池 1C 顯示細胞密度高達 2300 萬個細胞/mL，并且活力從第 11 天開始下降，并在同一天（第 14 天）達到約 83%。相比之下，從最高濃度的選擇劑中選出的 2D 池顯示出顯著延長的細胞活力以及池中最高的細胞密度（圖 1B 和 1C）。在池 2D 中，達到的峰值細胞密度約為 2600 萬個細胞/mL，第 14 天的細胞活力約為 92%，比包括親代 CHO 細胞在內(nèi)的其他兩個池（圖 1B 和 1C）高10-20 %，如上所述. 此外，我們分析了細胞在乳酸積累和消耗率方面的代謝行為，發(fā)現(xiàn)與其余池和親代細胞相比，2D 池在乳酸代謝方面存在顯著差異。池 2D 和 1C 以及池 1B 和親代 CHO 細胞的乳酸譜彼此相似，但是，池 2D 的乳酸產(chǎn)量顯著降低（圖 1D）與其他細胞池相比。由于這些池具有不同 PYC2 基因負載的異質(zhì)細胞群，并且在補料分批培養(yǎng)期間，異質(zhì)群的累積效應顯示細胞活力、密度和乳酸譜的變化，因此我們選擇 2D 池作為后續(xù)池的最終池單細胞克隆、篩選和建立潛在的工程細胞候選者。單細胞分選是使用 Guava? Muse-細胞分析儀通過為活的和良好的邊緣/邊緣細胞形狀設置有效門控來進行的（圖 1E）。細胞分選在白色背景下進行，不使用任何標記試劑/抗體。分選的單細胞最初在 384 孔板中生長，并通過使用 ZenCELL  innoME 活細胞動態(tài)成像分析儀在從第 0 天到第 17 天的不同時間間隔進一步監(jiān)測它們的生長模式（圖1F）。根據(jù)細胞/克隆的形態(tài)、生長和克隆性，我們挑出那些僅來源于單個細胞的菌落（通過細胞成像儀確認），然后將選定的菌落轉(zhuǎn)移并從低體積逐漸擴大到高體積按照材料和方法（ 圖 1E 和 1F）中的描述，進入多孔板，然后進入 T-25 燒瓶 . PYC2 克隆 #12 的克隆穩(wěn)定性研究還在補充有 6mM 谷氨酰胺（搖瓶）的基礎培養(yǎng)基 CD-Forti-CHO 中進行了 70 代，有和沒有選擇壓力，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性長達 50 代。

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