重組蛋白質(zhì)在生物醫(yī)學(xué)研究和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用中具有廣泛的用途。為了獲得高質(zhì)量的重組蛋白質(zhì)，需要進(jìn)行一系列的操作，包括表達(dá)、純化、復(fù)性和定量。本文將詳細(xì)介紹按照試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行的步驟，以幫助讀者全面了解重組蛋白質(zhì)的處理流程。

一、重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)：

1. 挑取轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的單菌落，接種于選擇性LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、250 rpm的條件下振搖培養(yǎng)過夜。

2. 次日將培養(yǎng)過夜的菌液用1:20的比例接種于選擇性LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、250 rpm的條件下培養(yǎng)至光密度（OD600=0.6）。取1 ml樣本作為誘導(dǎo)前標(biāo)本，以備后續(xù)分析。

3. 加入1 mol/L IPTG至菌液中，使終濃度為1 mM，在37°C、250 rpm的條件下繼續(xù)振搖培養(yǎng)4~5小時(shí)。取1 ml樣本作為誘導(dǎo)后標(biāo)本，收集菌體沉淀并凍存?zhèn)溆谩?/span>

4. 將誘導(dǎo)前后的菌體沉淀用20~40 μl PBS（pH=8.0）重懸，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，進(jìn)行煮沸加熱5 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。參照考馬斯亮藍(lán)染色法觀察結(jié)果。

二、重組蛋白質(zhì)的分離純化：

重組蛋白質(zhì)的可溶性鑒定：

1. 將按上述方法誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌體用裂解液1（Lysis buffer under native conditions）重懸，并在-80°C低溫冰箱中置放10 min。

2. 冰中解凍。

3. 在冰浴上用超聲破碎儀破菌6次，每次10 sec，間歇10 sec，電壓200-300 V。

4. 以10000g、4°C離心20min，收集上清液（溶液A），凍存于-20°C備用；將沉淀用同樣的裂解液1溶解（溶液B），同樣凍存于-20°C，供后續(xù)分析使用。

5. 將溶液A、溶液B和誘導(dǎo)前后的細(xì)菌進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用考馬斯亮藍(lán)染色方法，比較分析重組蛋白質(zhì)的溶解性。如果蛋白質(zhì)溶解于溶液A中，則為可溶性蛋白；如果溶解于溶液B中，則為非可溶蛋白。

重組蛋白質(zhì)為非可溶性蛋白（變性條件下）的分離純化：

1. 將菌體沉淀溶解于適量裂解液2（Lysis buffer under denaturing conditions），在室溫下攪拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。

2. 以10000g、4°C離心30 min，收集上清液。

3. 將Ni-NTA Agarose充填至柱子中，并連接于Pharmarcia低壓液相層析系統(tǒng)，用5倍柱體積的裂解液2平衡Ni-NTA Agarose，并調(diào)節(jié)A280值至零線。

4. 將適量上清液上樣至Ni-NTA Agarose柱中，并用裂解液清洗至A280值低于0.01。

5. 使用清洗液1和清洗液2分別進(jìn)行5~10倍柱體積的洗脫，直至A280值低于0.01。

6. 使用洗脫液（Elution buffer）洗脫重組蛋白質(zhì)，進(jìn)行A280值監(jiān)測，并收集出現(xiàn)峰線后含有重組蛋白的所有洗脫液。

三、重組蛋白質(zhì)的復(fù)性、凍干和定量：

1. 對(duì)純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行梯度降低的尿素溶液緩慢透析，最終使用0.01×PBS進(jìn)行透析。

2. 透析后的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行凍干，使其成粉狀。

3. 使用BIO-RAD公司的蛋白質(zhì)定量試劑，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)，采用比色測定方法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的定量。

重組蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化、復(fù)性和定量是獲得高質(zhì)量重組蛋白的關(guān)鍵步驟。這些步驟能夠幫助研究人員獲得高純度和活性的重組蛋白質(zhì)，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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