在 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)中，常用的分子生物學(xué)試劑按實(shí)驗(yàn)流程可分為載體構(gòu)建、gRNA 制備、細(xì)胞遞送、編輯檢測、篩選與修復(fù)五大核心環(huán)節(jié)，以下是常用到的生物試劑：

一、載體構(gòu)建階段

1. 限制性內(nèi)切酶

作用：切割質(zhì)粒載體和目的 DNA 片段，用于 gRNA 表達(dá)盒或 Cas9 表達(dá)載體的組裝。

常用酶：

BsaI：識別非常規(guī)回文序列（如 GGTCTC），切割后產(chǎn)生黏性末端，適用于 Golden Gate 克隆法，批量組裝 gRNA 表達(dá)單元（尤其適用于 CRISPR 文庫構(gòu)建）。

EcoRI、HindIII：傳統(tǒng)限制性內(nèi)切酶，比如百時(shí)美的EG15536S常用于質(zhì)粒線性化（如 pUC19、pSpCas9 載體）。

AgeI、AscI：稀有切點(diǎn)酶，減少載體內(nèi)部酶切位點(diǎn)干擾，提高克隆效率。

應(yīng)用場景：載體酶切→目的片段插入→連接反應(yīng)（需配合 T4 DNA 連接酶）。

2. DNA 連接酶

T4 DNA 連接酶：連接酶切后的載體與 gRNA 片段，形成重組質(zhì)粒。

Gibson 組裝試劑盒：基于同源重組的無縫克隆技術(shù)，無需酶切位點(diǎn)，直接拼接多個(gè) DNA 片段（如 Cas9 表達(dá)盒與 gRNA 陣列）。

3. 質(zhì)粒提取與純化試劑

質(zhì)粒小提試劑盒（如 Qiagen Miniprep）：從大腸桿菌中提取重組質(zhì)粒，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染或測序驗(yàn)證。

二、gRNA 設(shè)計(jì)與制備

1. gRNA 寡核苷酸合成

DNA 寡核苷酸：合成 gRNA 的 crRNA（靶向序列）和 tracrRNA 互補(bǔ)鏈，通常含 20nt 靶向序列 + PAM 鄰近序列（如 NGG）。

磷酸化試劑：如 T4 多核苷酸激酶（PNK），對寡核苷酸 5' 端磷酸化，提高連接效率。

2. 體外轉(zhuǎn)錄（IVT）試劑

RNA 聚合酶：如 T7 RNA 聚合酶，以 DNA 為模板轉(zhuǎn)錄 gRNA（需含 T7 啟動子序列），適用于體外合成 sgRNA（單鏈 gRNA）。

RNA 純化試劑盒（如 RNA Clean & Concentrator）：去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的 DNA 模板和雜質(zhì)，獲得高純度 sgRNA。

3. 引物與 PCR 試劑

PCR 引物：擴(kuò)增 gRNA 表達(dá)盒（如 U6 啟動子 + gRNA 序列），或用于載體構(gòu)建中的序列驗(yàn)證（如菌落 PCR）。

高保真 DNA 聚合酶（如 Q5、KOD）：確保擴(kuò)增序列無突變，尤其在構(gòu)建 CRISPR 文庫時(shí)避免靶向誤差。

三、細(xì)胞遞送與編輯

1. 轉(zhuǎn)染試劑

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑：如 Lipofectamine 3000、JetPrime，將重組質(zhì)?；?sgRNA/Cas9 核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物導(dǎo)入細(xì)胞（適用于貼壁細(xì)胞，如 HEK293T、HeLa）。

電轉(zhuǎn)染試劑盒：如 Nucleofector 電轉(zhuǎn)儀配套試劑，適用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞（原代細(xì)胞、免疫細(xì)胞）。

病毒包裝試劑：

慢病毒包裝質(zhì)粒（psPAX2、pMD2.G）：包裝 Cas9/gRNA 載體，感染分裂或非分裂細(xì)胞（如神經(jīng)元）。

AAV 載體系統(tǒng)：含 AAV 反向末端重復(fù)序列（ITR）、Cas9 基因，用于體內(nèi)遞送（需輔助質(zhì)粒 pAAV-RC、pAAV Helper）。

2. Cas9 蛋白與 RNP 復(fù)合物

重組 Cas9 蛋白：如 SpCas9-NLS（核定位信號修飾），與 sgRNA 體外組裝成 RNP，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)（避免質(zhì)粒整合）。

蛋白酶抑制劑：如 PMSF，在蛋白純化過程中保護(hù) Cas9 不被降解。

四、編輯效率檢測

1. PCR 與測序試劑

Taq PCR 試劑盒：擴(kuò)增編輯位點(diǎn)上下游 DNA，用于 Sanger 測序（檢測 Indels）或 TA 克隆后測序（分析突變頻率）。

高通量測序建庫試劑：如 Illumina TruSeq DNA Kit，對大量樣本進(jìn)行深度測序，定量脫靶效應(yīng)。

2. 錯(cuò)配切割酶

T7E1 核酸酶/ Surveyor 核酸酶：識別編輯后 DNA 雙鏈錯(cuò)配位點(diǎn)并切割，通過凝膠電泳檢測突變效率（適用于初步篩選）。

3. 熒光定量試劑

qPCR 試劑盒：檢測報(bào)告基因（如 GFP）的表達(dá)變化，評估基因敲除 / 激活效率（需構(gòu)建熒光報(bào)告載體，如 Cas9-dCas9 融合激活系統(tǒng)）。

五、篩選與修復(fù)過程

1. 篩選標(biāo)記試劑

抗生素：如嘌呤霉素（Puro）、G418（Neomycin），篩選穩(wěn)定整合 Cas9/gRNA 載體的細(xì)胞克隆（需載體攜帶抗性基因）。

流式細(xì)胞儀（FACS）：分選表達(dá)熒光標(biāo)記（如 mCherry）的陽性細(xì)胞，適用于無抗生素篩選的場景。

2. HDR 供體模板

單鏈寡核苷酸（ssODN）：含同源臂的修復(fù)模板，用于精確基因敲入（如點(diǎn)突變修復(fù)），需化學(xué)合成并經(jīng) PAGE 純化。

雙鏈 DNA 質(zhì)粒：作為 HDR 供體，攜帶大片段外源基因（如熒光蛋白基因），需配合 Cas9 切割誘導(dǎo)同源重組。

3. 堿基編輯相關(guān)試劑

脫氨酶融合蛋白：如胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1）或腺嘌呤脫氨酶（TadA），與 Cas9n（切口酶）結(jié)合，實(shí)現(xiàn)單堿基編輯（如 BE3、ABE 系統(tǒng)），無需 DSB 即可完成 C→T 或 A→G 替換。

尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）：保護(hù)編輯過程中產(chǎn)生的尿嘧啶不被修復(fù)，提高堿基編輯效率（常見于胞嘧啶堿基編輯器）。

六、輔助試劑與系統(tǒng)優(yōu)化

1. 細(xì)胞培養(yǎng)試劑

培養(yǎng)基與添加劑：如 DMEM、胎牛血清（FBS），維持細(xì)胞狀態(tài)；ROCK 抑制劑（Y-27632）提高干細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的存活率。

細(xì)胞裂解液：如 RIPA 緩沖液，提取細(xì)胞蛋白用于 Western blot 檢測 Cas9 表達(dá)。

2. 基因編輯工具盒

CRISPR 文庫篩選試劑盒：如 Broad Institute 的 GeCKO 文庫，包含靶向全基因組的 gRNA 陣列，用于功能基因篩選（需配合慢病毒包裝試劑）。

CRISPR 激活 / 抑制系統(tǒng)：dCas9-VPR（激活）或 dCas9-KRAB（抑制）質(zhì)粒，搭配 sgRNA 實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，需啟動子區(qū)域靶向 gRNA。

試劑分類與應(yīng)用流程圖

實(shí)驗(yàn)流程                核心試劑                                  作用

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載體構(gòu)建              限制性內(nèi)切酶（BsaI、EcoRI）、T4連接酶        切割/連接gRNA/Cas9載體

gRNA制備             IVT試劑盒（T7聚合酶）、DNA寡核苷酸           合成sgRNA

細(xì)胞遞送            轉(zhuǎn)染試劑（脂質(zhì)體/電轉(zhuǎn)）、病毒包裝質(zhì)粒           導(dǎo)入細(xì)胞/體內(nèi)遞送

編輯檢測            T7E1酶、PCR試劑、測序試劑盒                  評估突變效率與脫靶

篩選修復(fù)            抗生素、ssODN供體、堿基編輯器組分            篩選陽性細(xì)胞/精確修復(fù)

輔助優(yōu)化            細(xì)胞培養(yǎng)基、CRISPR文庫、蛋白酶抑制劑          系統(tǒng)優(yōu)化與功能擴(kuò)展

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實(shí)驗(yàn)試劑選擇策略與注意事項(xiàng)：

遞送效率：原代細(xì)胞先選電轉(zhuǎn)或病毒載體，貼壁細(xì)胞可用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。

檢測精度需求：初步篩選用 T7E1 酶，精準(zhǔn)分析需高通量測序。

修復(fù)類型選擇：基因敲除依賴 NHEJ（無需供體），精確編輯需 HDR（需 ssODN/dsDNA 供體）。

安全性考量：RNP 復(fù)合物（蛋白 + sgRNA）可減少質(zhì)粒整合風(fēng)險(xiǎn)，適用于醫(yī)學(xué)研究。

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