16年專注生物實驗室儀器設(shè)備&耗材綜合供應(yīng)
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熱門關(guān)鍵詞： 細胞培養(yǎng) 恒溫搖床 移液器使用規(guī)范 江蘇恒溫振蕩培養(yǎng)箱報價 生物反應(yīng)器
DNA聚合酶是實驗室中常用的生物學(xué)酶之一，在PCR實驗中具有重要的作用。實驗室常用的DNA聚合酶，包括Taq聚合酶、Pfu聚合酶和Tth聚合酶。
一、Taq聚合酶：
Taq聚合酶是由Thermus aquaticus細菌產(chǎn)生的一種DNA聚合酶，在分子生物學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。Taq聚合酶具有熱穩(wěn)定性，可以在高溫條件下保持活性，這是由于其來源于熱液生物，能夠存活和正?；顒佑诟邷丨h(huán)境。這使得Taq聚合酶在聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）中起到關(guān)鍵的作用。Taq聚合酶能夠按照DNA模板合成新的DNA鏈，因此在PCR中用于擴增目標DNA片段。然而，Taq聚合酶缺乏3'-5'外切酶活性，導(dǎo)致其生成的PCR產(chǎn)物末端容易出現(xiàn)額外的腺嘌呤堿基。因此，在某些應(yīng)用中，需要使用具有外切酶活性的聚合酶。
二、Pfu聚合酶：
Pfu聚合酶是由Pyrococcus furiosus細菌產(chǎn)生的一種DNA聚合酶。與Taq聚合酶相比，Pfu聚合酶具有更高的熱穩(wěn)定性和耐酶性。這使得Pfu聚合酶在高溫PCR反應(yīng)中表現(xiàn)出色，其高度穩(wěn)定的酶活性能夠確保PCR反應(yīng)的可靠性和準確性。此外，Pfu聚合酶還具有3'-5'外切酶活性，可以修復(fù)并糾正PCR反應(yīng)中的腺嘌呤堿基誤配，有效防止誤差累積。因此，Pfu聚合酶適用于需要高度準確的PCR擴增和DNA測序。
三、Tth聚合酶：
Tth聚合酶是由Thermus thermophilus HB8細菌產(chǎn)生的一種DNA聚合酶。與Taq聚合酶和Pfu聚合酶不同，Tth聚合酶具有熱活性反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶活性，可以將RNA模板合成相應(yīng)的DNA鏈。因此，Tth聚合酶在逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）中得到廣泛應(yīng)用，用于將RNA轉(zhuǎn)錄成DNA，并通過增加熱活性酶來實現(xiàn)PCR擴增。此外，Tth聚合酶還具有一定的外切酶活性，可用于修復(fù)和校正PCR產(chǎn)物的末端。
這三種酶的主要區(qū)別在于：Taq聚合酶適用于普通PCR擴增；Pfu聚合酶適用于需要高準確性的PCR擴增和DNA測序；Tth聚合酶適用于逆轉(zhuǎn)錄PCR。根據(jù)實驗的目的和需求，選用適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶有助于確保實驗數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。
1. 按下列組成在 PCR 反應(yīng)管中調(diào)制反應(yīng)液：
TaqTM 或 TaKaRa EXTaqTM 的配方
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Reagent |
Quantity, for 50μl of reaction mixt ure |
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10X PCR buffer （ Mg2+ free） |
5 μ l |
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MgCl2（25 mM） |
如 TaKaRa Taq TM 加 3 μl |
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如 TaKaRa EXTaqTM 加 4 μl |
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2.5mM dNTP mix |
4 μ l |
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10μM Primer 上游 |
1 μ l |
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10μM Primer 下游 |
1 μ l |
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Template DNA |
1 μ l |
|
Taq 或 E XTaqDNA Polymerase |
0.25 μl |
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Sterile deionized water |
Up to 50μl |
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Total |
50 μl /Sample |
PCR實驗中Pyrobest TM DNA Polymerase 的配方
|
Reagent |
Quantity, for 50μl of reaction mixture |
|
10X Pyrobest buffer |
5μ l |
|
2.5mM dNTP mix |
4μ l |
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10μM Primer 上游 |
1μ l |
|
10μM Primer 下游 |
1μ l |
|
Template DNA |
1μ l |
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Pyrobest TM DNA Polymerase |
0.25μl |
|
Sterile deionized water |
Up to 50μl |
|
Total |
50μl /Sample |
① 反應(yīng)總體積根據(jù)實際情況進行調(diào)控，可以做 20~50μl 以節(jié)約試劑；
② 將上表各成分加入到 0.2ml 或 0.5ml 滅菌的 PCR 薄壁管中；
③ 如果不用 PCR 儀的加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層加 30 ~50μl 的礦物油防止樣品在 PCR 的過程中蒸發(fā)；
2. 按以下程序進行 PCR 擴增。
PCR實驗中PCR 反應(yīng)條件視模板、引物等的結(jié)構(gòu)條件，PCR儀的不同而各異， 在實際操作中需根據(jù)具體的情況以及 PCR 結(jié)果而進行優(yōu)化。
|
Step |
Temperature, ° C |
Time, min |
Number of cycles |
Note |
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起始變 性 |
94~95 |
1-3 |
1 |
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|
變性 |
94~95 |
0.5-2 |
25-35 |
退火溫度比理論退火 溫度大概低 5°C ，再 根據(jù)反應(yīng)結(jié)果優(yōu)化 |
|
退火 |
37-70 |
0.5-2 |
||
|
延伸 |
70-75 |
根據(jù)擴 增產(chǎn)物 的大小 |
每分鐘延伸 1000bp |
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最終延 伸 |
70-75 |
10 |
1 |
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使用朗基PCR儀進行PCR反應(yīng)實驗結(jié)束后，抽取擴增樣品 5μl，用天能瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果，用 DNA marker 判斷擴增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用。
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