標(biāo)簽:微生物 微膠囊
微生物應(yīng)用技術(shù)在細(xì)胞工廠以及研究各種生物過(guò)程實(shí)驗(yàn)中起著重要作用,但是微生物的保存以及微生物培養(yǎng)的連續(xù)性一直是微生物應(yīng)用領(lǐng)域的難題。實(shí)踐證明,與在平板或發(fā)酵罐中連續(xù)傳代培養(yǎng)微生物培養(yǎng)物相比,建立微生物庫(kù)可以輕松實(shí)現(xiàn)微生物儲(chǔ)存和檢索。
根據(jù)儲(chǔ)存時(shí)間的長(zhǎng)短和微生物的種類,一般會(huì)采用不同的保存方法。長(zhǎng)期保存的主要原理是保持微生物長(zhǎng)期處于休眠狀態(tài),免受污染及遺傳變化,直到使用時(shí)使其恢復(fù)生機(jī)。這種方法通常是通過(guò)使用低溫和冷凍或干燥技術(shù)來(lái)減少細(xì)胞代謝活動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。近年來(lái),還有一種新型微生物保存技術(shù)是微膠囊化保存法,主要用于保存益生菌。
短期存儲(chǔ)(持續(xù)增長(zhǎng))
微生物的連續(xù)生長(zhǎng)可以在瓊脂培養(yǎng)基上維持很短的時(shí)間。微生物的瓊脂平板培養(yǎng)物在實(shí)驗(yàn)室冰箱 (4°C) 中可存活數(shù)周,而細(xì)菌培養(yǎng)物可在 4°C 下作為瓊脂刺培養(yǎng)物保存長(zhǎng)達(dá)一年。大多數(shù)微生物(細(xì)菌、真菌和藻類)都可以使用這種方法儲(chǔ)存,推薦用于經(jīng)常使用的培養(yǎng)物。使用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),這些培養(yǎng)物不斷生長(zhǎng),盡管在較低溫度下生長(zhǎng)速度較慢,使它們能夠在可用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用下存活更長(zhǎng)時(shí)間。
為了盡量減少瓊脂的污染和干燥,培養(yǎng)板應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室薄膜牢固地包裹起來(lái)并倒置存放(瓊脂面朝上)。在瓊脂培養(yǎng)基上短期儲(chǔ)存的主要優(yōu)勢(shì)是微生物容易回收。使用時(shí),只需將它們劃線到新鮮的培養(yǎng)板上或?qū)⑺鼈兘臃N到液體培養(yǎng)基中并在最佳生長(zhǎng)溫度下孵育!
然而,隨著時(shí)間的推移,瓊脂會(huì)變干,培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)被微生物耗盡。代謝廢物也會(huì)累積到有毒水平。營(yíng)養(yǎng)缺乏和有毒廢物的積累最終會(huì)導(dǎo)致儲(chǔ)存的微生物死亡。
A. 使用直線將單個(gè)細(xì)菌菌落放入一瓶軟瓊脂中,然后孵育形成瓊脂刺培養(yǎng)物。B.細(xì)菌在瓊脂培養(yǎng)基板上劃線并孵育。
長(zhǎng)期儲(chǔ)存
對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存,微生物在低于冰點(diǎn)(-20°C、-80°C 或液氮)的溫度下冷凍保存或冷凍干燥(凍干)。冷凍保存適用于范圍廣泛的細(xì)菌、藻類、真菌、病毒和原生動(dòng)物。超低溫會(huì)大大降低酶活性,從而降低微生物的代謝過(guò)程。為防止冰晶形成對(duì)細(xì)胞造成損害,在 -20°C、-80°C 或液氮 (-196°C) 下儲(chǔ)存之前,將細(xì)胞重新懸浮在含有冷凍保護(hù)劑(如甘油)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中?;蛘?,細(xì)胞也可以在冷凍前重新懸浮在脫脂牛奶中 。為了最大限度地提高回收率,建議在細(xì)胞濃度最高的生長(zhǎng)靜止期冷凍培養(yǎng)物。大多數(shù)培養(yǎng)物可以在 -20°C 的低溫小瓶(圖 2)中儲(chǔ)存至少一年,一些細(xì)菌原液在 -80°C 和液氮中儲(chǔ)存時(shí)仍可存活數(shù)十年!冷凍微生物可以通過(guò)在 37°C 下解凍并接種到新鮮培養(yǎng)基中而復(fù)活 。
上圖(微生物置于凍存管中)
冷凍干燥(凍干)通過(guò)在真空中將水轉(zhuǎn)化為冰來(lái)去除冷凍樣品中的水分,從而阻止微生物代謝過(guò)程并將細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干燥的顆粒,以便在安瓿中儲(chǔ)存和運(yùn)輸(圖 3)。冷凍干燥已被用于保存細(xì)菌、藻類、酵母、病毒和孢子形成真菌 。然而,凍干不適用于某些細(xì)菌和非孢子真菌,因?yàn)樗鼈儾荒茉诶鋬龈稍锏膲毫ο麓婊?。在接種到新鮮培養(yǎng)基中之前,可以通過(guò)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(細(xì)菌和藻類)、含有細(xì)菌宿主(噬菌體)或水(真菌和酵母)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中再水化細(xì)胞沉淀來(lái)回收凍干培養(yǎng)物 。
圖3 。 含有凍干微生物的安瓿。
如何使用微膠囊保存微生物?
微囊化,是指細(xì)胞在儲(chǔ)存前被包裹在基質(zhì)中,屬于一種長(zhǎng)期的微生物保存方法,此法避免了微生物長(zhǎng)期直接暴露于冷凍或干燥的嚴(yán)酷環(huán)境中。由于存在基質(zhì)保護(hù)細(xì)胞,增加儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性。當(dāng)在-80°C 下儲(chǔ)存時(shí),益生菌在藻酸鈣中的微膠囊化已被證明可以提高它們的生存力。益生菌被包裹在納米纖維和液滴當(dāng)中可以保持較強(qiáng)活力。
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