使用傳統(tǒng)體外方法生產(chǎn)的 EV 的深入表征和驗證由于需要大面積的細胞單層和大量的培養(yǎng)基，培養(yǎng)可能具有挑戰(zhàn)性。該實驗方法使用貼壁細胞生物反應(yīng)器系統(tǒng)以節(jié)省空間、資源和時間的方式同時培養(yǎng)多種不同亞型的乳腺癌細胞系，從而能夠持續(xù)生產(chǎn)大量用于下游實驗的 EV。

一、生物反應(yīng)器接種、適應(yīng)和維護

培養(yǎng)基 A：含有 10% 胎牛血清（FBS，Merck）和 1% 青霉素/鏈霉素（PS，Gibco）的 DMEM（Gibco）。

培養(yǎng)基 B：Advanced DMEM/F-12(Gibco)、2% CDM-HD (Fibercell)、2% FBS、1% Glutamax (Gibco) 和 1% PS。

培養(yǎng)基C：高級 DMEM/F-12、2% CDM-HD、1% Glutamax (Gibco) 和 1% PS。

     將細胞密度培養(yǎng)為1.5 × 10 6 個細胞/ml 的 15 mL細胞重懸液接種到貼壁生物反應(yīng)器的下部細胞室中（ Argos) 并在上層培養(yǎng)基室中加入 500 ml 相同培養(yǎng)基. 通過用培養(yǎng)基 A 代替培養(yǎng)基 C，細胞逐漸適應(yīng) CDM-HD 血清替代品（Fibercell Systems）和高級 DMEM/F12（以盡量減少 FBS 的使用）。細胞室每 3-4 天更新一次，培養(yǎng)基室更新一次每周。1 周后，培養(yǎng)基更改為 75%培養(yǎng)基A 和 25%培養(yǎng)基B。接下來的一周更改為 50% 培養(yǎng)基 A 和 50%培養(yǎng)基B，然后下一周更改為 25% 培養(yǎng)基 A 和 75%培養(yǎng)基 B。最后，在第 4 周，細胞室用 15 ml 預(yù)熱的 PBS 仔細清洗 3 次以去除任何殘留的 FBS  EV，并填充 15 ml 培養(yǎng)基 C，同時培養(yǎng)基室保持 500 ml 培養(yǎng)基 B。

      適應(yīng)后，從細胞室收集 15 ml 條件培養(yǎng)基用于 EV 分離，并每 3-4 天（星期一和星期四）更新一次，而細胞室每 7 天（星期四）更換一次。每次更換時記錄細胞室培養(yǎng)基體積（ml）。通過將 10 μl 完全條件培養(yǎng)基與 1:1 臺盼藍混合并在細胞計數(shù)儀上進行觀察和計數(shù)，將其用于懸浮細胞的定量。數(shù)字以“EV Collection #”表示，其中 EV Collection #1 對應(yīng)于接種后 28 天，此后每周進行兩次收集。

二、常規(guī)培養(yǎng)物比較

BT-474 和 MDA-MB-231 細胞在 2D 燒瓶中進行血清饑餓培養(yǎng)，以將 EV 產(chǎn)量與生物反應(yīng)器培養(yǎng)物進行比較。簡而言之，細胞在標準條件下在含有 10% FBS 和 1% P/S 的 DMEM 中培養(yǎng)，并通過使用 TrypLE (Gibco) 在其生長期（~80% 匯合度）分裂和重新接種，將每個培養(yǎng)瓶增至 9× T175 燒瓶. 將 9 × T175 燒瓶接種在含血清培養(yǎng)基中，達到約 30% 的匯合度，一旦細胞達到約 60% 的匯合度，就用 PBS 洗滌 3 次以去除任何殘留的外源性 FBS EV，并在 50 ml DMEM 中加入 1將 % P/S 添加到每個燒瓶中。48 小時后，收集條件培養(yǎng)基并以 2000× g離心10 分鐘，然后使用 Vivaspin 50、100 kDa 濃縮器濃縮，將培養(yǎng)基體積從 450 毫升減少到 40 毫升。使用尺寸排阻色譜法（SEC）對來自這種濃縮條件培養(yǎng)基的 EV 進行超速離心和純化。

在接種前，使用支原體染色試劑盒 (Sigma-Aldrich) 對常規(guī)細胞培養(yǎng)物和在生物反應(yīng)器中生長的培養(yǎng)物進行支原體檢測。

  生物反應(yīng)器實驗和維護示意圖。(a) 雙室 CELLine AD 1000 生物反應(yīng)器圖和用于分離和表征 EV 的工藝流程； (b) 生物反應(yīng)器維護方法顯示在接種和培養(yǎng)基適應(yīng)（4 周）后每周收集兩次 EV，每周更新一次培養(yǎng)基室；(c) 解構(gòu)后對生物反應(yīng)器生長表面進行成像的方法，包括 SEM 和 H&E 。

三、外泌體 EV隔離

    將來自生物反應(yīng)器細胞室的 15 ml 條件培養(yǎng)基以 2000 × g離心10 分鐘以去除細胞和其他碎片。然后按照制造商的說明使用高速離心機將上清液與 PBS 混合以達到小體積的 20 ml，以 10,000 x g離心30 分鐘以沉淀大型 EV（也稱為微泡）和該顆粒重新懸浮在 500 μl PBS 中并儲存。然后將上清液以 100,000 x g超速離心70 分鐘以產(chǎn)生粗制小 EV 顆粒。將該沉淀重懸于 700 μl PBS 中并儲存在 -80°C 直至需要，盡量減少冷凍解凍的次數(shù)。

   將 500 μl 粗小型 EV 加載到 35 nm  qEV Original SEC 柱上，并使用自動餾分收集器（每個餾分 500 μl）收集餾分 7 至 23。對每個收集的級分進行高靈敏度 BCA 測定（Pierce，ThermoFisher Scientific）以確定它們的蛋白質(zhì)濃度。一旦確定了富含 EV 的分數(shù)，只有那些富含 EV 的分數(shù)（由 NTA 填充的顆粒；F8-F10）被收集并匯集在隨后的分離中。

 四、納米粒子追蹤分析

     在 PBS 中以 1:100 的比例稀釋 SEC 純化的小型 EV 個體和合并的級分，并使用 NS300 Nanosight（Malvern Analytical）或Nanocoulter Ⅰ進行測量。在低流量條件下進行表征分析，如：平均和眾數(shù)粒徑、濃度、電位和尺寸分布。匯集了富含 EV 的部分，并用于跟蹤 EV 生產(chǎn)、TEM 和質(zhì)譜分析。使用 Kruskal-Wallis 檢驗在 Graphpad Prism 中對每個細胞系的 EV 產(chǎn)量和 EV 相關(guān)蛋白進行統(tǒng)計比較（P < 0.05) 在包括 Kolmogorov–Smirnov 和 Shapiro–Wilk 測試在內(nèi)的正態(tài)性測試呈陰性后。平均值以±標準偏差報告。散點圖以平均值和標準偏差呈現(xiàn)。

五、透射電鏡分析

通過吸附到 Formvar 涂層銅網(wǎng)格（電子顯微鏡科學(xué)）上 10 分鐘，對小型 EV 進行負染色 TEM。用濾紙（Whatman）去除多余的液體，然后將銅網(wǎng)格轉(zhuǎn)移到 20 μl 已過濾的 2% 乙酸雙氧鈾中 2 分鐘。用濾紙除去多余的液體，讓網(wǎng)格干燥 10 分鐘。網(wǎng)格在 TEM 上以 120 kV 加速電壓可視化，并拍攝圖像。

六、 免疫印跡

   合并的小型 EV 以 100,000 × g超速離心濃縮70 分鐘，并通過 BCA 測量蛋白質(zhì)水平。通過 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量（4 μg/泳道）的 SEC 純化的小型 EV 和細胞裂解物，并轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜（ Millipore) 。為防止非特異性結(jié)合，將膜與封閉溶液一起孵育使用 Pierce ECL Western Blotting Substrate (ThermoFisher Scientific) 使結(jié)合的抗體可視化，并使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進行分析。

七、無標記蛋白質(zhì)組學(xué)分析（SWATH-MS）

   將EV 在真空濃縮器（中濃縮至 150 μl 的體積。加入 150 μl 7 M 尿素、2 M 硫脲、5 mM DTT、0.1% SurfactAmps X-100 的 50 mM 碳酸氫銨溶液后，將樣品在聲波浴中超聲處理 15 分鐘。通過在 56°C 的加熱塊中孵育 20 分鐘來減少二硫鍵。 而后樣本處理后進行SWATH 分析。

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