熒光顯微鏡原理是通過激發(fā)式光源，將光學(xué)顯微鏡與化合物的熒光染料發(fā)射相結(jié)合的一種顯微觀察模式。當(dāng)今生物學(xué)中使用的多數(shù)熒光顯微鏡為落射熒光顯微鏡。

什么是熒光顯微鏡？

熒光顯微鏡 主要用于研究有機(jī)物和無機(jī)物等樣品 ，一般使用熒光和磷光來檢查樣品的結(jié)構(gòu)組織和空間分布比較適用于研究比較復(fù)雜且無法在傳統(tǒng)透射光顯微鏡下檢查的樣品。熒光顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別主要有兩方面別。一種是光源類型不同，另一種是使用的濾光片元件不同。

熒光顯微鏡的組件

強大的光源（氙氣燈或水銀弧光燈）：水銀弧光燈發(fā)出的光比大多數(shù)白熾燈亮 10-100 倍，并提供從紫外線到紅外線的各種波長的光。

激發(fā)濾光片：激發(fā)濾光片的目的是濾除光源的所有波長，被檢熒光團(tuán)的激發(fā)范圍除外。圖像的亮度和亮度由濾光片的最小透射百分比決定。理想的透射率> 85%。

分色鏡（分束器）：分色鏡或分束器以 45° 角放置在激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片之間。二向色濾光片的功能是將激發(fā)信號反射到熒光團(tuán)，并將發(fā)射信號傳輸?shù)綑z測器。

發(fā)射濾光片：發(fā)射濾光片位于熒光顯微鏡的成像路徑內(nèi)。它的工作是過濾掉整個激發(fā)范圍并傳輸被檢查熒光團(tuán)的發(fā)射范圍。

物鏡：物鏡的目的是將光傳輸?shù)綐悠飞弦孕纬蓤D像。光在到達(dá)物鏡之前穿過分色鏡。

攝像系統(tǒng)：攝像系統(tǒng)有助于以高分辨率記錄標(biāo)本的圖像。系統(tǒng)中經(jīng)常使用CCD（電荷耦合器件）相機(jī)。這些電子倍增相機(jī)擅長在不損失靈敏度的情況下對單光子事件進(jìn)行成像。它們不需要圖像增強器，并且可以高速捕獲圖像。

熒光顯微鏡有什么用途？

熒光顯微鏡可用于生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)。熒光顯微鏡有助于準(zhǔn)確和詳細(xì)地識別細(xì)胞和亞微觀細(xì)胞成分。

熒光顯微鏡的也被廣泛用于組織化學(xué)領(lǐng)域，以檢測常規(guī)顯微鏡無法看到的顆粒，例如神經(jīng)遞質(zhì)胺。

它在食品化學(xué)中用于評估產(chǎn)品中特定食品成分的存在、結(jié)構(gòu)組織和空間分布。

還有一種熒光散斑顯微鏡。它是一種使用熒光標(biāo)記的大分子組裝體（例如細(xì)胞骨架蛋白）來研究運動和周轉(zhuǎn)率的技術(shù)。

熒光顯微鏡染色也會在礦物學(xué)領(lǐng)域使用。它通常用于研究煤炭、氧化石墨烯等礦物。

它還廣泛用于紡織工業(yè)來分析纖維尺寸。落射熒光顯微鏡有助于研究基于纖維的材料，包括紙張和紡織品。

不僅如此熒光顯微鏡的使用還可以用于熒光染料研究陶瓷孔隙率以及半導(dǎo)體研究領(lǐng)域。

熒光顯微鏡中的光源

熒光顯微鏡原理使用高的強度近單色照明，常見廣源主要有4種，即：帶有激發(fā)濾光片的氙弧燈或汞蒸氣燈、超連續(xù)光源、大功率 LED 或激光器。 激光是共聚焦顯微鏡、全內(nèi)反射熒光顯微鏡 和其他復(fù)雜技術(shù)的常見選擇 。在使用寬場落射熒光顯微鏡的情況下，一般用氙燈、汞燈或帶二向色激發(fā)濾光片的 LED 較合適。寬視場落射熒光顯微鏡照明路徑中的兩個微透鏡陣列可以產(chǎn)生1%到2%的照明變化系數(shù)，具有較高的均勻性。

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熒光樣品制備

適用于熒光顯微鏡的樣品必須是熒光的才能適用于熒光顯微鏡檢查，熒光樣本制備常見的方法包括用熒光染料標(biāo)記、表達(dá)熒光蛋白或利用樣品的自發(fā)熒光。

生物熒光染料

熒光顯微鏡原理中一些染色劑可用于多種生物物質(zhì)。一些小分子具有它們自己的熒光和與之結(jié)合的優(yōu)選生物分子。例子包括 DAPI 和 Hoechst，它們被紫外光激發(fā)；以及 DRAQ5 和 DRAQ7，它們在紅光下激發(fā)最佳。它們中的每一個都與 DNA 的小溝結(jié)合，通過這樣的方式來標(biāo)記細(xì)胞核。其他一些污漬是肽、毒素和藥物，并與細(xì)胞結(jié)構(gòu)結(jié)合。這些必須用熒光報告子衍生，才能起作用。

免疫熒光和熒光蛋白

抗體與其對應(yīng)的抗原的結(jié)合，從而標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)或其他分子，這都是通過免疫熒光的過程實現(xiàn)的?，F(xiàn)代遺傳知識和技術(shù)使科學(xué)家可以編輯 DNA。相同的技術(shù)可用于對蛋白質(zhì)進(jìn)行基因修飾以添加熒光蛋白報告基因，這意味著科學(xué)家可以由此使某種蛋白質(zhì)發(fā)出熒光。一旦它發(fā)出熒光，就可以直接被追蹤，甚至在活細(xì)胞中也是如此。

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