本文通過(guò)分享一些在原核蛋白表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵技巧，旨在幫助科研人員獲得更高效的蛋白表達(dá)和提高可溶性表達(dá)的比例。我們將介紹蛋白特性及結(jié)構(gòu)的相關(guān)知識(shí)以及選擇蛋白表達(dá)宿主菌的方法。此外，我們還討論了一些常見問(wèn)題，如質(zhì)粒測(cè)序正確但蛋白無(wú)法表達(dá)、IPTG誘導(dǎo)后細(xì)胞停止生長(zhǎng)的原因和如何提高重組蛋白在原核細(xì)胞中的表達(dá)水平。最后，我們還探討了如何處理目的蛋白以不可溶形式出現(xiàn)的情況以及是否可以在蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部使用蛋白酶切除 His標(biāo)簽的問(wèn)題。

關(guān)鍵詞：原核蛋白表達(dá)、可溶性表達(dá)、質(zhì)粒測(cè)序、表達(dá)宿主菌、重組蛋白、目的蛋白、His標(biāo)簽

一、蛋白特性及結(jié)構(gòu)的了解

蛋白質(zhì)的特性和結(jié)構(gòu)對(duì)于優(yōu)化表達(dá)和純化非常重要。根據(jù)蛋白質(zhì)是否被研究過(guò)以及其是否為新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，可以采用不同的方法來(lái)推測(cè)其特性和結(jié)構(gòu)。對(duì)于未被研究過(guò)的蛋白質(zhì)，可以先測(cè)序部分氨基酸并設(shè)計(jì)引物進(jìn)行克隆。對(duì)于已被研究過(guò)的蛋白質(zhì)，可以通過(guò)軟件預(yù)測(cè)其特性和結(jié)構(gòu)，例如使用swiss-pdb軟件或在NCBI上進(jìn)行blastx得到蛋白質(zhì)序列。

二、選擇蛋白表達(dá)宿主菌

在選擇蛋白表達(dá)宿主菌時(shí)，要考慮原核系統(tǒng)和真核細(xì)胞的密碼子偏好性差異。密碼子優(yōu)化可以根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)密碼子的偏好性進(jìn)行優(yōu)化篩選，以提高蛋白的表達(dá)水平和可溶性表達(dá)比例。通?？梢詤⒄彰艽a子優(yōu)化表格選擇適合的宿主菌。

三、質(zhì)粒測(cè)序正確但蛋白無(wú)法表達(dá)

出現(xiàn)質(zhì)粒測(cè)序正確但蛋白無(wú)法表達(dá)的情況可能有多種原因。首先，分析一下是否存在稀有密碼子，如果存在較多可嘗試使用rosetta(DE3)宿主進(jìn)行表達(dá)。其次，可能是基因本身的問(wèn)題，如RNA3'的特殊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄問(wèn)題，可以嘗試融合表達(dá)，比如使用pET-32a載體。另外，也可能是表達(dá)量過(guò)低，可以嘗試使用Western blot等方法定性檢測(cè)表達(dá)情況。

四、IPTG誘導(dǎo)后細(xì)胞停止生長(zhǎng)

當(dāng)使用IPTG誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞可能會(huì)停止生長(zhǎng)，但并不意味著細(xì)胞死亡。這是因?yàn)?/span>T7 RNA聚合酶非常活躍，轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)強(qiáng)烈，一旦誘導(dǎo)，細(xì)胞的主要生理活動(dòng)會(huì)轉(zhuǎn)向目的蛋白的表達(dá)。在常規(guī)情況下，細(xì)胞將停止生長(zhǎng)，克隆產(chǎn)量大大降低，但并未完全死亡。可以通過(guò)菌落形成試驗(yàn)來(lái)測(cè)試表達(dá)系統(tǒng)的功能。

五、提高重組蛋白在原核細(xì)胞中的表達(dá)水平（可溶性表達(dá)）

為了提高蛋白在原核細(xì)胞中的表達(dá)水平，特別是可溶性表達(dá)，我們可以嘗試以下方法。首先，降低重組蛋白合成速率，可通過(guò)減慢蛋白質(zhì)合成速率、折疊速率和聚集速率來(lái)提高可溶性蛋白的比例。其次，進(jìn)行密碼子優(yōu)化來(lái)改善mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而有利于蛋白的正確折疊和外源活性蛋白的表達(dá)。此外，可以選擇適宜的表達(dá)溫度、誘導(dǎo)條件和培養(yǎng)基來(lái)優(yōu)化表達(dá)條件。

六、處理可溶性蛋白以不可溶形式出現(xiàn)的情況

在某些實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白以不可溶性的形式出現(xiàn)，形成包涵體。這種情況并非總是壞事。形成包涵體可能是表達(dá)量高的表現(xiàn)，使簡(jiǎn)單的初步分離成為可能，并且包涵體中的蛋白通常不受蛋白酶的水解破壞。為了處理這種情況，可以嘗試降低誘導(dǎo)溫度、降低IPTG濃度并延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間，或者在透析過(guò)程中加入底物或類似物來(lái)促進(jìn)蛋白重折疊的效果。

七、His標(biāo)簽包在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部是否可用蛋白酶切除

一般情況下，一旦His標(biāo)簽包含在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部，使用常規(guī)方法如蛋白酶切除通常會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性。因此，如果需要在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部引入His標(biāo)簽并且希望能夠切除，通常需要在構(gòu)建蛋白質(zhì)的時(shí)候使用相關(guān)的遺傳工程技術(shù)。例如，可以在蛋白質(zhì)的N-或C-端設(shè)計(jì)一個(gè)TEV蛋白酶切割位點(diǎn)，通過(guò)TEV蛋白酶將His標(biāo)簽從蛋白質(zhì)中切除。這樣可以在蛋白質(zhì)表達(dá)純化過(guò)程中保持蛋白質(zhì)的完整性和活性。需要注意的是，在使用蛋白酶切除His標(biāo)簽之前，確保蛋白質(zhì)已經(jīng)得到充分的純化和驗(yàn)證。

了解蛋白質(zhì)特性和結(jié)構(gòu)以及選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主菌，可以提高蛋白表達(dá)的效率和可溶性表達(dá)的比例。同時(shí)，合理選擇誘導(dǎo)條件、優(yōu)化表達(dá)溫度和培養(yǎng)基，以及進(jìn)行密碼子優(yōu)化等方法，也可以提高重組蛋白在原核細(xì)胞中的表達(dá)水平。對(duì)于出現(xiàn)目的蛋白以不可溶形式出現(xiàn)的情范，可以嘗試進(jìn)行重折疊和再溶解的方法。重折疊是通過(guò)將不可溶性蛋白質(zhì)以封裝體的形式納入到蛋白質(zhì)體中進(jìn)行再折疊的過(guò)程。這一方法可以使原本不可溶的蛋白質(zhì)得以重折疊為可溶性的形式。再溶解則是將不可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行再溶解的過(guò)程，這可以通過(guò)添加一些溶解劑或改變環(huán)境條件來(lái)實(shí)現(xiàn)。

   此外，還可以嘗試使用蛋白質(zhì)工程的方法，如點(diǎn)突變、插入突變或刪除突變，以改變蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)，從而增加其可溶性。此外，還可以使用融合標(biāo)簽或輔助蛋白質(zhì)，如分子伴侶蛋白、分泌信號(hào)序列或其他輔助蛋白質(zhì)來(lái)增加蛋白質(zhì)的可溶性。

另外，在進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化步驟時(shí)，使用不同的洗滌緩沖液、蛋白質(zhì)溶解液和洗脫緩沖液，也可以改善蛋白質(zhì)的溶解度和可溶性。選擇合適的純化方式，如親和層析、離子交換層析或凝膠過(guò)濾等，也可以幫助提高蛋白質(zhì)的溶解度和純化效率。

綜上所述，通過(guò)綜合運(yùn)用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)工程技術(shù)、條件優(yōu)化和純化方法等，可以改善重組蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)，從而提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量和純度。

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