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Cas9基因點(diǎn)突變技術(shù)服務(wù)

Cas9基因點(diǎn)突變技術(shù)服務(wù)針對(duì)不同單堿基突變的情況使用不同的Mutation載體策略：包括短同源臂可以使用Oligo引入突變，需要長(zhǎng)同源臂的使用ssDNA引入突變。而針對(duì)難以操作的細(xì)胞系，將需要通過先構(gòu)建Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株再進(jìn)行g(shù)RNA和載體共轉(zhuǎn)染來(lái)提高效率。Cas9X針對(duì)每個(gè)具體的位點(diǎn)、每個(gè)具體的細(xì)胞優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件用來(lái)滿足不同細(xì)胞系和不同位點(diǎn)突變的服務(wù)需求。

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Cas9基因點(diǎn)突變 技術(shù)服務(wù)

Cas9-Cell line Gene Mutation service（CGM）基因點(diǎn)突變細(xì)胞系是細(xì)胞基因研究方法中一個(gè)重要手段，它可以在細(xì)胞內(nèi)原位對(duì)點(diǎn)突變的功能進(jìn)行研究。在細(xì)胞系上實(shí)現(xiàn)高效的轉(zhuǎn)染是實(shí)現(xiàn)基因點(diǎn)突變的前提；提高效率要解決問題是：Cas9切割位點(diǎn)與“點(diǎn)突變”位點(diǎn)之間距離導(dǎo)致點(diǎn)“點(diǎn)突變”效率大幅下降的問題，還有“點(diǎn)突變”載體的選擇問題。

目前 Cas9基因點(diǎn)突變 技術(shù)服務(wù)使用Cas9的引入基因“點(diǎn)突變”的具體實(shí)驗(yàn)實(shí)踐中的“單堿基突變”的效率仍然受到很多要素的影響，例如是否在點(diǎn)突變附近是否存在有合適的gRNA切割位點(diǎn)、切割位點(diǎn)和突變位置之間距離、不同細(xì)胞系之間的Cas9切割活性效率差異的問題、還有細(xì)胞株是否存在“假基因”和基因“多拷貝”的問題導(dǎo)致無(wú)法獲得純合的問題等等。

Cas9基因點(diǎn)突變 技術(shù)服務(wù)針對(duì)不同單堿基突變的情況使用不同的Mutation載體策略：包括短同源臂可以使用Oligo引入突變，需要長(zhǎng)同源臂的使用ssDNA引入突變。而針對(duì)難以操作的細(xì)胞系，將需要通過先構(gòu)建Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株再進(jìn)行g(shù)RNA和載體共轉(zhuǎn)染來(lái)提高效率。Cas9X針對(duì)每個(gè)具體的位點(diǎn)、每個(gè)具體的細(xì)胞優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件用來(lái)滿足不同細(xì)胞系和不同位點(diǎn)突變的服務(wù)需求。

Cas9 基因點(diǎn)突變 技術(shù)原理

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客戶案例

| 項(xiàng)目名稱：

構(gòu)建Ret 基因點(diǎn)突變(E623K)的小鼠胚胎干細(xì)胞
| 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
種屬：Mouse；基因名稱：Ret 突變信息：E623K（GAG to AAG）

WT序列：
gccagggcattaaagcaggctacggcatctgcaactgtttccctgatgagaagaaatgcttctgcGAGCCAGAGga
cagccagggtaagtcatgcctcccacacagttccccaacctcccctaaccctcaagggagtt
gRNA位點(diǎn)序列：GAAATGCTTCTGCGAGCCAGAGG

oligo序列：
ggcatctgcaactgtttccctgatgagaagaaatgcttctgcAAGCCAGAAgacagccagggtaagtcatgcctcccacacagttccccaacc

MT序列：
gccagggcattaaagcaggctacggcatctgcaactgtttccctgatgagaagaaatgcttctgcAAGCCAGAAga
cagccagggtaagtcatgcctcccacacagttccccaacctcccctaaccctcaagggagtt

備注：在E623K（GAG to AAG）基礎(chǔ)上，引入同義突變E625E (GAG to GAA)防止發(fā)生gRNA位點(diǎn)被再次切割。

策略圖：

基因點(diǎn)突變技術(shù)原理

細(xì)胞信息
種屬：Mouse；細(xì)胞名稱：胚胎干細(xì)胞

細(xì)胞檢測(cè)
無(wú)菌檢測(cè)：合格；支原體檢測(cè)：合格
細(xì)胞克隆形成率檢測(cè)：細(xì)胞增殖能力較好，克隆形成率較好。
細(xì)胞基因型檢測(cè)：針對(duì)gRNA打靶位置及其附近基因組序列進(jìn)行測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果與理論序列一致。

細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)
電轉(zhuǎn)參數(shù)：1400V, 20ms, 1次；電轉(zhuǎn)體系：10 uL

PCR篩選
篩選克隆數(shù)量：185；雜合子數(shù)量：19；純合子數(shù)量：3

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