天根miRcute多糖多酚植物miRNA提取分離試劑盒 DP504

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

操作步驟：

 使用前在漂洗液RWA和去蛋白液MRD中加入C?H?O，加入量請(qǐng)參見瓶上標(biāo) 簽。 

一、miRNA富集部分的提取 對(duì)miRNA的純度要求較高時(shí)，比如miRNA芯片研究、miRNA克隆建議采用此方法。 

1．勻漿處理 50 mg植物葉片或果實(shí)果肉在液氮中迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入到1.5 ml離心管中，加入500 μl裂解液SLM，顛倒混勻以保證裂解液浸沒所 有樣本，再加入1/10裂解液體積的助沉劑PLA，立即渦旋震蕩混勻。

 注意 1：對(duì)于預(yù)期RNA得率小于10 μg的植物樣本，請(qǐng)使用100 mg的起始樣本量；對(duì)于富 含淀粉的樣本或成熟葉片，請(qǐng)將裂解液SLM用量增加至700 μl。 

注意 2：由于植物多樣性非常豐富，而且同種植物的不同生長發(fā)育階段和不同組織RNA含 量都不相同，請(qǐng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況選擇合適的樣本量。 

2．室溫，12,000 rpm(~13,400×g) 離心5 min。

 3．將上清液轉(zhuǎn)移至過濾柱CS上(過濾柱CS放在收集管中)，室溫12,000 rpm(~13,400×g) 離 心2 min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收 集管中的細(xì)胞碎片沉淀。 

4. 量取轉(zhuǎn)移液的體積，緩慢加入轉(zhuǎn)移液體積0.43倍的C?H?O， 混勻（此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀）。將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱 miRspin中，室溫 12,000 rpm (~13,400×g)離心30 sec。若一次不能全部加入到吸附柱 miRspin中，請(qǐng)分兩次轉(zhuǎn)入，離心后棄掉吸附柱miRspin，保留流出液。

 5. 量取流出液的體積，緩慢加入流出液體積0.75倍的C?H?O，混勻（此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀）。將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR4 中，室溫 12,000 rpm (~13,400×g)離心30 sec，若一次不能全部加入到吸附柱CR4中， 請(qǐng)分兩次轉(zhuǎn)入，離心后棄掉流出液，保留吸附柱CR4。

6. 向吸附柱CR4中加入700 μl去蛋白液MRD，室溫靜置2 min，室溫 12,000 rpm (~13,400×g)離心30 sec，棄廢液。

 7. 向吸附柱CR4中加入500 μl漂洗液RWA（請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇），室溫靜置2 min， 室溫 12,000 rpm (~13,400×g)離心30 sec，棄廢液。

 8. 重復(fù)操作步驟7。 

9. 將吸附柱CR4放入2 ml收集管中，室溫 12,000 rpm (~13,400×g)離心2 min，去除殘余液 體。

 注意：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，離心后將吸附柱CR4在室溫放置2 min，或置于超凈工作臺(tái)上通風(fēng)片刻，以充分晾干。如果有漂洗液殘留，可能會(huì)影響后續(xù) 的RT等實(shí)驗(yàn)操作。

10. 將吸附柱CR4轉(zhuǎn)入一個(gè)新的RNase-Free 1.5 ml離心管中，加50 μl RNase-Free ddH2O， 室溫放置2 min，室溫 12,000 rpm (~13,400×g)離心2 min。

 注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于30 μl，體積過小影響回收效率。且RNA應(yīng)保存在-70℃， 以防降解。

注意：如果想提高RNA得率，可重復(fù)上步操作一次。

二、 Total RNA的提取 提取的total RNA中含有miRNA等small RNA。

對(duì)miRNA的純度要求不高時(shí)，比如在研 究miRNA RT-PCR、miRNA Northern blot時(shí)也可以采用此方法。

1. 勻漿處理 50 mg植物葉片或果實(shí)果肉在液氮中迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入到1.5 ml離心管中，加入500 μl裂解液SLM ，顛倒混勻以保證裂解液浸沒所有 樣本，再加入1/10裂解液體積的助沉劑PLA ，立即渦旋震蕩混勻。

 注意1：對(duì)于預(yù)期RNA得率小于10 μg的植物樣本，請(qǐng)使用100 mg的起始樣本量；對(duì)于富 含淀粉的樣本或成熟葉片，請(qǐng)將裂解液SLM用量增加至700 μl。

 注意2：由于植物多樣性非常豐富，而且同種植物的不同生長發(fā)育階段和不同組織的RNA 含量都不相同，請(qǐng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況選擇合適的樣本量。

 2. 室溫，12,000 rpm(~13,400×g) 離心5 min。

 3. 將上清液轉(zhuǎn)移至過濾柱CS上(過濾柱CS放在收集管中)，12,000 rpm(~13,400×g) 離心2 min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集 管中的細(xì)胞碎片沉淀。

 4．緩慢加入1.5倍上清體積的C?H?O，混勻（此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀），將得到的溶液和 沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR4中， 12,000 rpm(~13,400×g)離心30 sec，倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱CR4放回收集管中。

若一次不能全部轉(zhuǎn)入吸附柱CR4 ，請(qǐng)分兩步進(jìn)行。 注意：如果上清液體積有損失，請(qǐng)相應(yīng)調(diào)整無水乙醇的加量。 

5．向吸附柱CR4中加入700 μl去蛋白液MRD(使用前請(qǐng)檢查是否已加入乙醇)，12,000 rpm(~13,400×g)離心30 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR4放回收集管中。