組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化介質(zhì) Ni IDA Beads介紹

      Ni IDA Beads可以用于各種表達(dá)來(lái)源（如大腸桿菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞）的組氨酸標(biāo)簽（6xHis-tagged）蛋白的純化。它是以4%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)方法偶聯(lián)了三配位的亞氨基二乙酸（IDA），螯合鎳離子（Ni2+）后，可以形成比較穩(wěn)定的平面四邊形結(jié)構(gòu)，從而有更多的位點(diǎn)與組氨酸標(biāo)簽上的咪唑環(huán)繼續(xù)配位，達(dá)到結(jié)合目的蛋白的效果。但是，這樣的結(jié)構(gòu)比較容易受到其他小分子的進(jìn)攻，鎳離子易被還原或者被螯合，從而破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu)，無(wú)法結(jié)合目的蛋白。Ni IDA Beads具有載量高，性能和價(jià)值匹配等優(yōu)點(diǎn)。

表1. Ni IDA Beads產(chǎn)品性能

2.純化流程

2.1 緩沖液的準(zhǔn)備

可使用下列推薦緩沖液，也可根據(jù)自己的使用習(xí)慣配置不同的緩沖液體系，基本原理就是低咪唑上樣，高咪唑洗脫。緩沖液在使用前盡量用0.22 μm 或者0.45 μm 濾膜過(guò)濾除菌。具體配置方法見(jiàn)表2。

2.2純化流程

2.2.1 細(xì)菌或酵母表達(dá)的蛋白

1）挑取單菌落到培養(yǎng)基中，根據(jù)載體使用說(shuō)明，加入相應(yīng)濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)相應(yīng)的時(shí)間。

2）表達(dá)結(jié)束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中，7，000 rpm（7，500×g），離心15min 收集菌體，然后按照菌體∶Lysis Buffer=1∶10（WNV）加入

Lysis Buffer，加入終濃度為 1mM的 PMSF。加入溶菌酶（工作濃度為 0.2-0.4 mg/ml，如果表達(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含 pLysS 或 pLysE，可以不加溶菌酶），同時(shí)也可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與樹(shù)脂的結(jié)合）。

3）將菌體沉淀懸浮起來(lái)，（如果菌液濃度高，也可考慮加入10 ug/ml RNase A和5 μg/ml DNase I），混勻，放置于冰上，然后冰上超聲破

碎細(xì)胞，至菌液基本保持澄清。

4）將澄清的破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中，10，000 rpm（15，000×g），4℃離心 20-30 min。取上清，置于冰上備用或-20℃保存。

2.2.2 酵母、昆蟲(chóng)和哺乳細(xì)胞分泌表達(dá)可溶性蛋白

1）將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心杯，5.000 rpm（3.800×g）;離心10min，收集菌體得上清，如上清中不含 EDTA、組氨酸和還原劑等物質(zhì)，即可直接加入柱子使用;如含有 EDTA、組氨酸和還原劑等物質(zhì)，需用Lysis Buffer 透析才能加入柱子。2）對(duì)于大量體積的上清，需加入硫酸銨沉淀濃縮后，蛋白還需用 Lysis Buffer 透析后才能加入柱子。

2.3 Ni IDA Beads 重力柱的裝填

1）取合適規(guī)格的重力層析柱，裝入下墊片，加入適量純水潤(rùn)洗柱管和墊片，關(guān)閉下出口。

2）將 Ni IDA Beads 混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中（介質(zhì)實(shí)際體積占懸液的一半），打開(kāi)下出口流干保護(hù)液。

3）加入適量純水沖洗介質(zhì)，待柱管中液體重力流干后，關(guān)閉下出口。

4）裝入潤(rùn)洗后的上墊片，確保墊片與填料之前沒(méi)有空隙，且保持水平。

5）裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進(jìn)行平衡，暫不使用時(shí)則加入保護(hù)液，4-30℃保存。

2.4 樣品純化流程

2.4.1 孵育法純化

1）根據(jù)純化的樣品量，取適量 Ni IDA Beads加入離心管中，1000 rpm 離心 1min，吸棄上清;也可加入重力柱中，流干保護(hù)液。2）向離心管中加入5倍介質(zhì)體積的Lysis Buffer 清洗介質(zhì)，1000 rpm 離心1min，吸棄上清;如使用重力柱，則直接在重力柱中清洗，直接重力流干Lysis Buffer;重復(fù)兩次以上。

3）加入樣品，封閉離心管或重力柱管，4℃振蕩孵育2-4 h 或者37℃孵育30 min-2 h。

4）孵育結(jié)束后，1000 rpm 離心1 min，吸棄上清，或過(guò)濾收集介質(zhì)，上清保留作為流穿，用于電泳鑒定。

5）用5倍介質(zhì)體積的Wash Buffer 清洗介質(zhì)，1000 rpm 離心 1min 或重力柱管過(guò)濾，去除上清（注意不要吸到介質(zhì)），重復(fù)3-5次，中間建議更換新離心管。必要時(shí)可以調(diào)整咪唑的濃度進(jìn)行洗雜。

6）加入3-5倍柱體積的 Elution Buffer 進(jìn)行洗脫，室溫孵育10-15 min，1000 rpm 離心1min 或重力柱管收集洗脫液，可重復(fù)2-3次。

2.4.2 重力柱法純化

1）將裝填好的 Ni IDA Beads 重力柱用5倍柱體積 Lysis Buffer 進(jìn)行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖液體系下，重復(fù) 2-3次。

2）將樣品加到平衡好的重力柱中，樣品保留時(shí)間至少2 min;保證樣品和介質(zhì)充分接觸，收集流出液，可以反復(fù)上樣增加結(jié)合效率。

3）用 10-15倍柱體積的 Wash Buffer 進(jìn)行洗雜，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。必要時(shí)可以調(diào)整咪唑的濃度進(jìn)行洗雜。

4）使用5-10倍柱體積的 Elution Buffer 洗脫，分段收集，每一個(gè)柱體積收集一管，分別檢測(cè)，既可以保證所有結(jié)合的目的蛋白被洗脫，又可以得到高純度和高濃度的蛋白。

上述步驟介質(zhì)洗脫結(jié)束后，先用Lysis Buffer 沖洗3倍柱體積，然后用純水沖洗5倍柱體積，再用 20%乙醇沖洗2個(gè)柱體積，然后將介質(zhì)置于2-8℃保存。2.5 SDS-PAGE 檢測(cè)

將使用純化產(chǎn)品得到的樣品（包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用 SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。

3.在位清洗

當(dāng)填料使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)反壓過(guò)高或者填料上面出現(xiàn)明顯的污染時(shí)，需要進(jìn)行在位清洗操作（Cleaning-in-Place，CIP）。

建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

去除強(qiáng)疏水結(jié)合的蛋白，脂蛋白和脂類

通過(guò)使用 30%異丙醇清洗 5-10個(gè)柱體積，接觸時(shí)間為 15-20 min 可以去除此類污染物。然后，再使用 10倍柱體積的去離子水清洗。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液，清洗填料 2倍柱體積。例如，含有0.1-0.5%非離子去污劑的 0.1 M 醋酸溶液，接觸時(shí)間為 1-2 小時(shí)。去污劑處理后。需要使用70%的乙醇清洗5個(gè)柱體積。以徹切底去除去污劑。最后使用10倍柱體積的夫離子水清洗。

去除離子作用結(jié)合的蛋白 

使用 1.5M NaCI溶液清洗 10-15 min。然后，再使用去離子水清洗 10個(gè)柱體積。

4.填料再生

組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化填料所帶的鎳離子不需要經(jīng)常螯合去除和重新掛鎳離子。當(dāng)填料使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)顏色變淺，或者填料載量明顯變低時(shí)，需要進(jìn)行對(duì)填料進(jìn)行鎳離子剝離和重新掛鎳離子，也就是填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內(nèi)，按照下面操作流程進(jìn)行鎳離子剝離和重新掛鎳離子。

1）使用5倍柱體積去離子水清洗填料;

2）使用5倍柱體積100 mM EDTA（pH 8.0）剝落鎳離子;

3）使用10倍柱體積去離子水清洗填料;

4）使用0.5M NaOH清洗5倍柱體積，停留 10-15min;

5）使用去離子水清洗填料，直至 pH中性;

6）使用 3-5倍柱體積 100 mM NiSO4再生掛鎳;

7）使用10倍柱體積去離子水清洗;

填料再生后，可以立即使用，如不立即使用，需要將填料懸浮干等體積的 20%乙醇中，置于2-8°℃保存。

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