抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）由于其結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性而存在獨特的分析挑戰(zhàn)，動態(tài)體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化途徑需要復(fù)雜的生物分析方法。 ADC 的主體是抗體，所以ADC的藥代動力學與未偶聯(lián)的單克隆抗體有許多相似的地方，例如半衰期長、清除率低等。然而，偶聯(lián)小分子藥物導(dǎo)致ADC異質(zhì)性增加，因此不僅需要通過 ELISA 實現(xiàn)精準定量，還需借助電泳分離、發(fā)光檢測等技術(shù)驗證ADC完整性與偶聯(lián)效率——這一過程中，可靠的實驗設(shè)備是確保分析結(jié)果準確性的關(guān)鍵支撐。

 本文以Trastuzumab-MMAE（曲妥珠單抗-MMAE，HER2 靶向 ADC）為例，系統(tǒng)比較ADC藥代動力學評估的通用與特異性檢測方法，詳細闡述方法開發(fā)、驗證流程及實驗室儀器設(shè)備的 應(yīng)用場景，為ADC 定量分析提供 “方法+ 設(shè)備 ” 的完整解決方案。

實驗材料和方法

1. 總抗體生物分析測定

我們開發(fā)并評價了用于定量Trastuzumab-MMAE總抗體的三種ELISA方法，核心依賴熒光酶標儀 實現(xiàn)吸光度精準讀取：

① 通用夾心ELISA法：抗人IgG 多克隆抗體同時捕獲和檢測抗體）；

② 通用夾心ELISA法：捕獲抗體為抗人IgG 單克隆抗體，檢測抗體為抗人 IgG多克隆抗體；

③ 間接ELISA法：捕獲試劑為人HER2 ，檢測抗體為抗人 IgG抗體。

圖1. 開發(fā)并評估定量分析Trastuzumab-MMAE總抗體的三種方法

（圖注：包含TMB、抗人IgG抗體、 Trastuzumab-MMAE ADC、 HER2等關(guān)鍵組分的作用示意）

2. 結(jié)合抗體的特異性ELISA

針對Trastuzumab-MMAE偶聯(lián)抗體的定量，除ELISA核心流程外，需通過Western Blot+化學發(fā)光成像 驗證偶聯(lián)效率，具體方法如下：

① 特異性夾心ELISA法：抗MMAE 抗體為捕獲抗體，生物素化 HER2結(jié)合ADC和 HRP-SA 為檢測抗體；

② 特異性間接ELISA法：抗MMAE 抗體為捕獲抗體，抗人 IgG單克隆抗體為檢測抗體；

③ 輔助驗證：采用SDS-PAGE分離Trastuzumab 與 Trastuzumab-MMAE，通過化學發(fā)光成像確認偶聯(lián)后蛋白分子量變化，排除未偶聯(lián)抗體干擾。

圖2. 開發(fā)并評估兩種方法定量Trastuzumab-MMAE特異性抗體

（圖注：原文圖示，展示抗MMAE抗體作為捕獲試劑，與Trastuzumab-MMAE ADC的結(jié)合及后續(xù)檢測流程）

3. 實驗試劑與設(shè)備

表1. 主要試劑

表2. ELISA所用試劑

表3. 核心實驗設(shè)備（來自天能，適配ADC分析全流程）

4. 實驗流程

4.1 ELISA定量流程

1.  包被：用包被緩沖液稀釋蛋白（抗人IgG/HER2），加入酶標板（42592 ，Corning ），4℃孵育過夜（ 16 h ）；

2.  洗滌：每孔加300 μL洗滌緩沖液洗4 次，徹底去除殘留液，倒置酶標板干燥；

3.  封閉：每孔加300 μL封閉緩沖液，37℃ 孵育1 h ；

4.  洗滌：重復(fù)步驟2；

5.  加樣：100 μL梯度稀釋的Trastuzumab-MMAE 樣本（樣本稀釋液稀釋），37℃ 孵育1 h；

6.  洗滌：重復(fù)步驟2；

7.  加檢測抗體：100 μL HRP標記抗體（抗體稀釋液稀釋），37℃ 孵育1 h ；

8.  洗滌：重復(fù)步驟2；

9.  加底物：200 μL底物溶液，37℃ 避光孵育20 min ；

10.  終止反應(yīng)：每孔加50 μL 1 mol/L硫酸；

11.  吸光度讀取：使用天能Feyond-F100熒光酶標儀 ，在450 nm波長下讀取 OD值，自動計算 “ 最終OD值 = 樣本 OD???- 空白孔OD???”。

4.2 ADC偶聯(lián)效率驗證流程

1.  蛋白樣品制備：取Trastuzumab（裸抗）與Trastuzumab-MMAE （偶聯(lián)物）各 20 μg，加入5×SDS上樣緩沖液， 95℃變性5 min ；

2.  電泳分離：將樣品加入天能VE-180垂直電泳槽 的凝膠孔中，設(shè)置電壓（濃縮膠80 V，分離膠 120 V），電泳 60-90 min 至溴酚藍到達凝膠底部；

3.  轉(zhuǎn)膜與孵育：將凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后加入抗人IgG-Fc 抗體（1:5000 稀釋），4℃孵育過夜，再加入 HRP二抗（1:10000 稀釋）， 37℃ 孵育1 h；

4.  化學發(fā)光檢測：膜上滴加ECL底物，放入天能Tanon 4800化學發(fā)光凝膠成像儀 ，曝光1-5 min ，觀察條帶：Trastuzumab-MMAE條帶分子量150 kDa ），確認偶聯(lián)成功；

5.  凝膠質(zhì)量檢查：電泳后的PAGE膠放入天能Tanon 4100全自動凝膠成像系統(tǒng) ，紫外燈下觀察條帶完整性，無拖尾則說明分離合格。

1. 總抗體檢測結(jié)果

三種ELISA方法在測試濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出優(yōu)異線性（R2>0.99），裸抗與 Trastuzumab-MMAE 的檢測靈敏度相當，說明藥物偶聯(lián)未影響抗體識別。通過天能Feyond-F100熒光酶標儀 的精準讀數(shù)，方法① （雙抗人 Fc多克隆抗體法）的批間精密度（ CV<15%）與回收率（90%-110% ）最優(yōu)，確立為總抗體定量的首選方法。

2. 偶聯(lián)抗體檢測與設(shè)備輔助驗證結(jié)果

兩種特異性ELISA方法均表現(xiàn)出穩(wěn)定性能（R2>0.99， CV<15%），不同抗 MMAE抗體克隆株（M1H09/M1G04 ）無顯著差異（圖5 A-B）。通過天能VE-180電泳槽+Tanon 4800成像儀 的輔助驗證，Western Blot結(jié)果顯示：Trastuzumab-MMAE條帶分子量較裸抗增加約 5-10 kDa （ MMAE偶聯(lián)導(dǎo)致），且無未偶聯(lián)裸抗條帶，說明 ELISA 檢測的偶聯(lián)抗體均為有效偶聯(lián)產(chǎn)物，排除假陽性干擾。

本研究通過“ELISA定量+電泳 / 成像驗證”的組合策略，實現(xiàn)了Trastuzumab-MMAE 總抗體與偶聯(lián)抗體的精準分析，其中適配的實驗設(shè)備 為實驗可靠性提供了關(guān)鍵支撐：

?  天能Feyond-F100熒光酶標儀確保ELISA吸光度讀取的準確性，減少空白干擾與人為誤差；

?  天能VE-180/HE-90電泳槽實現(xiàn)ADC蛋白的高效分離，為偶聯(lián)效率驗證奠定基礎(chǔ)；

?  天能Tanon 4800/Chemi Dog 5200T成像系統(tǒng)精準捕捉化學發(fā)光信號，直觀驗證ADC 偶聯(lián)完整性。

在ADC藥代動力學分析的實際應(yīng)用中，建議結(jié)合“方法選擇 +實驗室儀器設(shè)備適配 ” 雙重維度：先選擇雙抗人Fc 多克隆抗體 ELISA法（總抗體）與抗 MMAE 夾心 ELISA 法（偶聯(lián)抗體），同時搭配天能電泳 -成像設(shè)備組合進行輔助驗證，確保分析結(jié)果的準確性與可重復(fù)性。

此外，Tanon Chemi Dog ULTRA全自動發(fā)光成像系統(tǒng)、Tanon 1600凝膠成像儀可兼容不同實驗規(guī)模（從小樣本驗證到高通量篩選），為 ADC 的全開發(fā)周期提供穩(wěn)定的技術(shù)支持。

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