我們知道所謂DNA文庫(DNA library)是指，來自特定生物有機體基因組的全部DNA片段之每一條片段，都與克隆載本單獨形成重組分子，此種包含有該特定生物有機體之全部DNA片段的重組克隆分子的集合體，稱做DNA文庫。簡言之，是生物有機體的基因組DNA片段化之后形成的成千上萬的DNA片段都被同一克隆載體所克隆。因此生物有機體的全部遺傳信息通過基因文庫(DNA文庫)中的各種克隆得到了保存與體現(xiàn)，猶如書庫保藏著人類的全部知識一樣。

由此可見，基因克隆與分離的頭一步就必須對基因組DNA進行片段化。

(1)核酸內(nèi)切限制酶的切割法

真核基因組DNA經(jīng)核酸內(nèi)切限制酶消化之后不進行凝膠電泳分部分離而直接與克隆載體重組，這種克隆方法，在早期研究中使用過，特稱為“鳥槍法(shotgun approach)”。

缺點:

①形成的重組體分子，實際上是一群帶有不同大小的插入片段的重組載體的混合群體。造成目的基因篩選困難、工作量大、費時、費力、費錢。

②有些目的基因的核苷序列中可能會存在一個甚至數(shù)個限制酶識別位點。因此，克隆的目的基因有可能被切成若干片段。

③產(chǎn)生的有些片段可能太大，有些片段又可能太小，因此有些基因無法被克隆，形成不完全的基因庫。

(2)機械切割法

構(gòu)建DNA文庫最好使用隨機片段化的方法制備DNA的克隆片段。機械切割法和限制酶局部消化法處理基因組DNA，都可以產(chǎn)生出隨機片段化的DNA克隆片段群體；

機械切割的標準狀況是：1500轉(zhuǎn)/分攪拌器中高速攪拌，30分鐘便可將DNA分子切成平均長度8kb的分子群體。

(3)限制酶局部消化

用來產(chǎn)生DNA克隆片段的限制酶，必須考慮到它對DNA序列應(yīng)該具有最佳的識別位點分布規(guī)律。例如選用l噬菌體載體構(gòu)建基因文庫，就不能夠承載大小25Kb的EcoRI片段，在這種情況下最好選用識別序列為4bp的Sau3A、HaeⅢ以及AluI等限制酶。

(4)DNA片段的大小分部

*蔗糖密度梯度離心——除去不適于克隆的過大或過小的DNA片段；

*瓊脂糖凝膠電泳——此法可以在很窄的范圍內(nèi)獲得高純度的某種DNA片段，或是大小同源的DNA片段。此法的缺點是，瓊脂糖的污染有時會抑制爾后的酶催反應(yīng)。

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