文章標簽:組氨酸 緩沖液 咪唑  親和層析 蛋白質(zhì)純化 

     重組蛋白的表達和隨后的蛋白質(zhì)純化被廣泛用于生化研究。其中一些蛋白純化方法涉及使用肽親和標簽，這些標簽與目的蛋白質(zhì)融合，并用于通過親和層析加速蛋白質(zhì)純化。金屬親和層析法IMAC就是一種常用的蛋白純化方法，它可用于快速純化多組氨酸親和標簽蛋白，在一個純化步驟中可實現(xiàn) 100 倍的富集。 IMAC甚至可以以高產(chǎn)率獲得高達 95% 的親和標簽蛋白純度。

      IMAC法的實質(zhì)是利用固定化金屬親和層析 (IMAC) 來純化含有由多組氨酸殘基組成的短親和標簽的重組蛋白。IMAC 基于過渡金屬離子（Co 2+、Ni 2+、Cu 2+、Zn 2+) 固定在基質(zhì)和特定氨基酸側(cè)鏈上。組氨酸是與固定化金屬離子基質(zhì)相互作用最強的氨基酸，因為組氨酸咪唑環(huán)上的電子供體基團很容易與固定化過渡金屬形成配位鍵。包含連續(xù)組氨酸殘基序列的肽可有效保留在 IMAC 柱基質(zhì)上。洗滌基質(zhì)材料后，可以通過調(diào)節(jié)柱緩沖液的 pH 值或向柱緩沖液中添加游離咪唑，輕松洗脫含有多組氨酸序列的肽。

一、蛋白質(zhì)結(jié)合、洗滌和洗脫步驟的設(shè)計

     多組氨酸標簽蛋白的結(jié)合可以使用柱或分批程序進行。細胞裂解應在調(diào)節(jié)至 pH 8.0 的緩沖溶液中進行。當使用柱程序時，將樹脂填充到柱中，并將細胞裂解物緩慢加載（每小時 3 到 4 柱體積）到柱上。分批程序包括在細胞裂解液中孵育親和基質(zhì)樹脂，然后將樹脂裝入柱中。在 4° 孵育期間，可通過搖晃或攪拌將樹脂懸浮在細胞裂解液中。使用分批程序通常會導致更有效的標記蛋白結(jié)合。無論使用哪種方法，都建議使用最少量的樹脂來結(jié)合標記的蛋白質(zhì)。與非特異性結(jié)合樹脂的其他蛋白質(zhì)相比，標記的蛋白質(zhì)通常具有更高的結(jié)合親和力。因此，當使用少量樹脂時，標記的蛋白質(zhì)將填充大部分可用的結(jié)合位點，從而減少結(jié)合的非特異性蛋白質(zhì)的數(shù)量。氯化鈉（最長 500 mM ) 和低水平的咪唑（最高 20 m M）也可以包含在結(jié)合緩沖液中，以減少與樹脂非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)數(shù)量。

     除金屬螯合劑（如 EDTA）外，大多數(shù)蛋白酶抑制劑都可以包含在所有緩沖液中。金屬螯合親和層析，又稱固定化金屬離子親和層析。該方法主要利用蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸，如組氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能和金屬離子發(fā)生特殊的相互作用，形成穩(wěn)定的螯合物從而進行分離。主要以配位鍵結(jié)合為主。

    由于金屬螯合親和層析具有配體簡單、吸附量大、分離條件溫和、通用性強等特點，已成為重組蛋白質(zhì)的分離純化的一個重要工具?？梢杂糜诟鞣N表達來源（如大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞）的組氨酸標簽蛋白質(zhì)純化。金屬螯合親和層析法主要使用的實驗材料包括：Ni IDA Beads， Ni IDA Beads 6FF,Ni NTA Beads,Ni NTA Beads重力柱, HisPur Ni NTA Kit,Ni NTA Beads 6FF,Ni NTA Beads 6FF重力柱, HisCap 6FF,Ni Smart Beads,Ni Smart Beads 重力柱, Ni Smart Beads 6FF,Ni Smart Beads 6FF 重力柱, HisCap Smart 6FF等.

       結(jié)合標記的蛋白質(zhì)后，可以洗滌柱子以去除與柱子弱結(jié)合的非特異性蛋白質(zhì)。如果需要，在洗滌緩沖液中加入咪唑（Ni 2+ –NTA 為 10–50 m M，Co 2+ –CMA 為10 m M）將增加洗滌的嚴格性并有效地洗脫非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)?；蛘撸梢允褂?pH 值低于結(jié)合緩沖液（Ni 2+ –NTA 的 pH 為 6.3，Co 2+ –CMA 的 pH 為 7.0）的洗滌緩沖液去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。洗滌劑、2-巰基乙醇和氯化鈉等試劑通常包含在洗滌和結(jié)合緩沖液中，以減少非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合。

       洗脫目的標記蛋白主要有三種方式。降低 pH 值（Ni 2+ -NTA 為 5.3-4.5 ，Co 2+ -CMA為6.0）使組氨酸殘基的咪唑氮原子質(zhì)子化（p Ka 6.0）并破壞組氨酸和過渡金屬之間的配位鍵. 組氨酸類似物咪唑也可用于競爭性洗脫結(jié)合的多組氨酸殘基（Ni 2+ –NTA濃度為 100 m M或更高，Co 2+濃度為 50 m M或更高–CMA)。如果標記的蛋白質(zhì)形成寡聚體，則可能需要更嚴格的條件，例如低的 pH 值或高濃度的咪唑來洗脫蛋白質(zhì)。雖然這兩種洗脫方法都有效，但多數(shù)會使用咪唑，因為暴露于低 pH 值可能會損壞目標蛋白質(zhì)。但請注意，在 SDS-PAGE 之前將含有咪唑的樣品加熱至沸騰會導致酸不穩(wěn)定鍵水解。相反，建議在分析前將樣品在 SDS 上樣緩沖液中加熱至不超過 37° 并保持 5 分鐘。包括螯合劑，例如 EDTA (100 m M) 在洗脫緩沖液中，可以促進蛋白質(zhì)從樹脂中的洗脫。這種處理會將金屬原子從基質(zhì)中剝離出來，從而導致洗脫液受到污染。洗脫液中螯合劑或金屬的存在也可能會干擾酶活性。此外，在使用螯合劑后，如果不重新充電，則不能重復使用該基質(zhì)。 

二、可溶性多組氨酸標簽蛋白的天然純化方案

       該實驗方案設(shè)計原理是在非變性條件下使用 Ni 2+ -NTA 樹脂從大腸桿菌中純化帶有六個 N 末端組氨酸殘基的可溶性 ERK2 蛋白。雖然這種方案可能需要對其他多組氨酸標簽蛋白進行輕微的優(yōu)化，但它是作為純化天然狀態(tài)下可溶性蛋白的起點。實驗過程中，可以將尿素或鹽酸胍添加到緩沖液中，以在變性條件下執(zhí)行純化。也可以在緩沖液中添加其他試劑，包括去污劑、2-巰基乙醇和各種蛋白酶抑制劑，也可以添加到緩沖液中以防止非特異性結(jié)合或蛋白水解。

      使用鎳-次氮基三乙酸 (Ni 2+ -NTA) 基質(zhì)對具有代表性的多組氨酸標簽蛋白純化進行 SDS-PAGE 分析。圖中顯示了等體積的細胞裂解物、在分批步驟中未能與樹脂結(jié)合的穿透材料、將樹脂裝入柱子后獲得的洗滌材料以及柱子的洗脫液。通過考馬斯染色使 15% Laemmli 凝膠可視化。

蛋白質(zhì)純化步驟如下：

1.通過在加載緩沖液（300 m M NaCl、50 m M NaH 2 PO 4、pH 至 8.0 用 NaOH）中的冰上超聲處理來裂解表達標記蛋白的細胞。每克細胞應使用大約 3–5 ml 上樣緩沖液。盡可能保持裂解液低溫，以盡量減少可能的蛋白水解。

2.通過在 4° 下以 30,000 g旋轉(zhuǎn) 30 分鐘立即離心裂解物。

3.將在冰冷加載緩沖液中預平衡的50% Ni 2+ -NTA 漿液 (Qiagen) 添加到上清液中。加入足量的 50% Ni 2+ -NTA 漿液以結(jié)合多組氨酸標簽蛋白（5–10 mg/ml 樹脂）。以 4° 攪拌或旋轉(zhuǎn) 1 小時。

4將樹脂加載到柱子上。用 20 柱體積的 4° 上樣緩沖液清洗樹脂。

5.在 4°下用 20 柱體積的洗滌緩沖液洗滌樹脂（與上樣緩沖液相同，但也含有 10 m M咪唑，pH 至 8.0 與 HCl）。

6. 在上樣緩沖液中使用 20 柱體積梯度 10 至 250 m M咪唑進行洗脫（pH 至 8.0，使用 HCl）。收集 1-ml 級分并使用 SDS-PAGE 分析含有所需蛋白質(zhì)的級分并匯總。

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