本文系統(tǒng)解析Western Blot蛋白免疫印跡操作流程（樣本裂解/電泳/轉(zhuǎn)膜/封閉/抗體孵育/顯影），詳解PVDF膜處理、一抗?jié)舛葍?yōu)化等關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)，提供條帶異常、高背景等常見問(wèn)題解決方案，附試劑配置表與避坑清單，助您獲得可重復(fù)性結(jié)果！

一個(gè)基因表達(dá)終極結(jié)果是產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)（或酶）。因此檢測(cè)蛋白質(zhì)是測(cè)定基因表達(dá)的主要標(biāo)志，檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法很多，除ELISA法外，也可用與檢測(cè)DNA和RNA相類似的吸印方法。前兩法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸稱為Western（西）印跡法，該法能用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨出與專一抗血清結(jié)合的專一性蛋白質(zhì)。將聚丙烯酰胺凝膠上分辨出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并與第一抗體共孵。第一抗體專一地與待分離蛋自質(zhì)的抗原決定簇結(jié)合，然后用另一種蛋自質(zhì)，如135I ^- 蛋白A或辣根過(guò)氧化物酶連接的山羊抗IgG檢測(cè)已結(jié)合上去的抗體。本法所需時(shí)間6小時(shí)或過(guò)夜。

(一)蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳

幾乎所有蛋白質(zhì)電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行，而所用條件總要確保蛋白質(zhì)解離成單個(gè)多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。最常用的方法是將強(qiáng)陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，并通過(guò)加熱使蛋白質(zhì)解離后再加樣于電泳凝膠上。變性的多肽與SDS結(jié)合并因此而帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無(wú)關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在聚丙烯酰凝膠電泳中的遷移只與多肽的大小相關(guān)。在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽約可結(jié)合1.4克去污劑，借助已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)參照物，則可測(cè)算出多肽鏈的分子量。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行，其電泳槽緩沖液的pH值與離子強(qiáng)度不同于配膠緩沖液，當(dāng)兩電極間接通電流后，凝膠中形成移動(dòng)界面，并帶動(dòng)加入凝膠的樣品中所含的SDS多肽復(fù)合物向前推進(jìn)。樣品通過(guò)高度多孔性的積層膠后，復(fù)合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱積層）。曲于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的復(fù)合物全部濃縮于極小體積的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝膠的分辨率。

最廣泛使用的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)設(shè)計(jì)的，樣品和積層膠中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽緩沖液含Tris^-甘氨酸(pH8.3)，分離膠中含Tris-Cl(pH8.8)的。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1%的SDS(Laemmli,1970)，樣品和積層膠中的氯離干形成移動(dòng)界面的先導(dǎo)邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動(dòng)界面的兩邊界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域，它推動(dòng)樣品中的多肽前移并在分離膠前沿積聚，此處pH值較高，有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過(guò)堆集的多肽并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動(dòng)。從移動(dòng)界面中解脫后，SDS多肽復(fù)合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動(dòng)穿過(guò)分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。

【材料】

分離膠及積層膠溶液

水飽和異丁醇

1×Tris?Cl/SDS,pH8.8

蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)混合物

1×SDS電泳緩沖液

電泳裝置及夾子、玻璃板、灌膠支架、緩沖液槽等附件

0.75mm封邊墊片

0.75mm樣品梳子

50μl微量進(jìn)樣器

恒流電源

【常用試劑】

1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亞甲丙烯酰胺

將30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亞甲丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中，加熱至37℃溶解之，補(bǔ)加水至終體積為100ml。0.45μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，查證該溶液pH應(yīng)不大于7.0，置棕色瓶中保存。

小心：丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可通過(guò)皮膚吸收，其作用具有累積性。稱量丙烯酰胺和N,N’-亞甲丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無(wú)毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能含有少量未聚合材料。

2）4×Tris?Cl/SDS,pH8.8,

在300mlH₂O中溶解91g Tris堿(1.5mol/L)，用1mol/L調(diào)節(jié)pH至8.8,補(bǔ)加H₂O至體積500ml。用0.45μm濾膜過(guò)濾溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。

3）4×Tris?Cl/SDS,pH6.8,

在40mlH₂O中溶解6.05g Tris堿(0.5mol/L)，用1mol/L調(diào)節(jié)pH至6.8,補(bǔ)加H₂O至體積100ml。用0.45μm濾膜過(guò)濾溶液，再加入0.4g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。

4）4×SDS電泳緩沖液

Tris base 24.2 g

Glycerin 115.3 g

20%SDS 20 ml

加水至總體積1000ml。

應(yīng)用時(shí)稀釋4倍即為1×SDS電泳緩沖液(Tris 0.05M,Glycerin 0.38M,SDS 0.1%)。

5）TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)

TEMED通過(guò)催化過(guò)硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亞甲丙烯酰胺的聚合。

6）10%過(guò)硫酸銨

過(guò)硫酸銨提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和亞甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基?？捎萌ルx子水配制小量10%(w/v)的貯存液并保存于4℃。由于過(guò)硫酸銨會(huì)緩慢分解，故應(yīng)隔周新鮮配制。

【步驟】

1）按廠商的使用指南用兩塊干凈的玻璃，平板和0.75mm墊片組裝電泳裝置中的玻璃平板夾層，并固定在灌膠支架上。

2）按表7.1配制分離膠液體并脫氣，然后加入10%的過(guò)硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌混勻。

聚丙烯酰胺分離膠的配制

試劑成分 配制不同濃度分離膠所需試劑(ml)

5% 8% 10% 12% 15%

Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.50

4×Tris?Cl/SDS,pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75

H₂O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.75

10%過(guò)硫酸銨 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

按所需分離的蛋白質(zhì)分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度，一般地，5%的凝膠可用于60～200kDa的SDS變性蛋白質(zhì)分子的分離，10%用于16～70kDa，15%用于12～45kDa。

3）用一根巴斯德吸管立即將分離膠液體沿夾層中一條墊片的邊緣加入于玻璃平板夾層中，至凝膠約5cm高為止。樣品體積少于10μl不需灌制積層膠。

4）用另一根已斯德吸管，先從一邊的墊片，再?gòu)牧硪贿厜|片往夾層的液面頂部緩緩加入一層水飽和異丁醇（厚約1cm）。讓凝膠在室溫聚合30min。

聚合后，可見在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線，膠的聚合失敗往往問(wèn)題在于過(guò)硫酸按或TEMED，或兩者都有。

5)傾去頂層的異丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS,pH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部表面,盡量用吸水紙吸干。

6)按表7.2配制積層膠液體，用吸管將液體沿一條墊片加入到玻璃平板夾層，直至夾層的頂部。

聚丙烯酰胺積層膠的配制

GEL%（3.9%） Total (10.05ml)

Acry:Bis(30:0.8) 1.30 ml

4×Tris?Cl/SDS,pH6.8 2.50 ml

H₂O 6.10 ml

10%過(guò)硫酸銨 0.05 ml

TEMED 0.01 ml

7)將0.75mm厚的梳子插入夾層的積層膠液體中，必要時(shí)，再補(bǔ)加積層膠液體充盈剩余空間。讓積層膠室溫聚合30min。

8)在具螺口蓋的微量離心管中，用2×SDS加樣緩沖液按1:1(v/v)稀釋待測(cè)蛋白質(zhì)樣品，于100℃煮沸5-10min。如樣品是蛋白質(zhì)沉淀物，加入50～100μl 1×SDS加樣緩沖液溶解之，并同樣在100℃煮沸5-10min。按供應(yīng)商的使用指南用2×SDS加樣緩沖液溶解蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)混合物。

對(duì)于0.3cm寬的加樣孔，推薦加樣體積以不超過(guò)20μl 為宜。用考馬斯亮藍(lán)染色法顯跡，成分很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物需加25～50μg，而樣品中只有一種或不多的幾種蛋白的話，只需1～10μg蛋白量。采用銀染顯跡時(shí)，樣品用量可減小10～100倍（按樣品的復(fù)雜程度在小于20μl的體積溶有0.01～0.5ng蛋白樣品不等）。

2×SDS加樣緩沖液(loading buffer)配制：

成分 體積(ml)

0.5M Tris?Cl (pH6.8) 12.5

20%SDS 11.5

Glycerin 10

2% Blue-Bromo-phenol 2.5

β-mercaptoethanol * 5.0

加H₂O至總體積50 ml，分裝

*β-mercaptoethanol 在臨用前加入。

9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝膠加樣孔。取出梳子后，以1×SDS電泳電泳緩沖液沖洗加祥孔，并以此緩沖液充滿之。

10）按廠商指南將凝膠板固定到電泳裝置的上緩沖液室（上槽），同時(shí)往下緩沖液室（下槽）加入推薦量的1×SDS電泳緩沖液。

11）將固定于上槽的凝膠板放入下槽中，并往上槽加入部分電泳緩沖液至剛好淹沒凝膠的加樣孔。

12）用帶平嘴針頭的50μl注射器將同樣濃度的蛋白質(zhì)樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部成一薄層，對(duì)照孔加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)樣品，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×SDS樣品緩沖液，以防相鄰泳道樣品的擴(kuò)散。

13)再往上槽加入余下的1×SDS電泳緩沖液。此操作緩慢小心，以防沖起樣品孔中的樣品。

14）連接電源，對(duì)于0.75mm厚的垂直板電泳，先在60V下電泳至溴酚藍(lán)染料從積層膠進(jìn)入分離膠，再將電壓調(diào)至120V繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部為止。

15）關(guān)閉電源并撤去連接的導(dǎo)線，棄去電泳緩沖液。連同上槽一起將凝膠夾層取出。

16）將凝膠定位以便識(shí)別加樣的順序，將凝膠板從上槽解離出來(lái)，放在一疊吸水紙或紙巾上。

17）小心將封邊的墊片抽出一半，并以此為杠桿橇起上面的玻璃平板，使凝膠暴露出來(lái)。

18）小心從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認(rèn)出加樣次序，接著就可進(jìn)行蛋白質(zhì)的檢測(cè)。

(二)蛋白質(zhì)從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持體

目前進(jìn)行的Western印跡反應(yīng)大多還是從凝膠上直接把蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜之上。把凝膠的一面與硝酸纖維素濾膜相接觸，然后將凝膠及與之相貼的濾膜夾于濾紙、兩張多孔墊料以及兩塊塑料板之間。把整個(gè)結(jié)合體浸泡于配備有標(biāo)準(zhǔn)鉑電極并裝有pH8.3的Tris^-甘氨酸緩沖液的電泳槽中，使硝酸纖維素濾膜靠近陽(yáng)極一側(cè)，然后接通電流約0.5小時(shí)。在此期間，蛋白質(zhì)從凝膠中向陽(yáng)極遷移而結(jié)合下硝酸纖維素濾膜上。為了防止過(guò)熱并因而導(dǎo)致在夾層中形成氣飽，轉(zhuǎn)移過(guò)程應(yīng)在冷室中進(jìn)行。

【步驟】

1）當(dāng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳行將結(jié)束時(shí)，用蒸餾水淋洗電極板，然后用不被吸收的紙巾揩干電極板上粘附的液滴。

2）戴上手套，切6張濾紙和1張硝酸纖維素濾膜，其大小都應(yīng)與凝膠大小完全吻合。如果濾紙或?yàn)V膜面積大于凝膠，濾紙和濾膜伸出的邊緣就大有機(jī)會(huì)相接觸，造成電流短路而使蛋白質(zhì)不能從凝膠向?yàn)V膜轉(zhuǎn)移。用鉛筆在濾膜一角作好標(biāo)記。拿取凝膠、濾紙和硝酸纖維素濾膜時(shí)必須戴手套。因?yàn)槠つw上的油脂和分泌物會(huì)阻止蛋白質(zhì)從凝膠向?yàn)V膜轉(zhuǎn)移。

3）把硝酸纖維素濾膜漂浮于一盤去離子水的水面上，借毛細(xì)作用使之從下往上濕潤(rùn)后，將之浸沒于水中，浸泡5分鐘以上以驅(qū)除留于濾膜上的氣泡。

4）在一淺托盤中加入少量轉(zhuǎn)移緩沖液，把6張濾紙浸泡于其中。

轉(zhuǎn)移緩沖液

190 mmol/L甘氨酸

25 mmol/L Tris堿

20% 甲醇

配制IL轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取14.4g甘氨酸、3g Tris堿，并加入200ml甲醇，加水至總量為1L。

5）戴上手套按如下方法安裝轉(zhuǎn)移裝置：

a.平放底部電極（陰極），放一張海綿墊片。

b.在海綿墊片上放置3張用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過(guò)的濾紙，逐張疊放，精確對(duì)齊，然后用一玻璃移液管作滾筒以擠出所有氣泡。

d.從電泳槽上撤出放置SDS聚丙烯酰胺凝膠的玻璃，把凝膠轉(zhuǎn)移到一盤去離子水中略為漂洗一下，然后準(zhǔn)確平放于硝酸纖維素濾膜上。把凝膠左下角置于硝酸纖維素濾膜的標(biāo)記角上，戴手套排除所有氣泡。切記：為避免發(fā)生短路，不要切去凝膠的左下角。

c.把硝酸纖維素濾膜放在聚丙烯酰胺凝膠上，要保證精確對(duì)齊，而且在硝酸纖維素濾膜與聚丙烯酰胺凝膠之間并不留有氣泡。

e.把最后3張3濾紙放在硝酸纖維素濾膜上方，同樣須確保備層精確對(duì)齊并不留氣泡。

6）將靠上方的電極（陽(yáng)極）放于夾層物上，連接電源。根據(jù)凝膠面積按300mA接通電流，電轉(zhuǎn)移0.5-1.0小時(shí)。

7）斷開電源并拔下槽上插頭，從上到下拆卸轉(zhuǎn)移裝置，逐一掀去各層。將凝膠轉(zhuǎn)移至盛有考馬斯亮藍(lán)染液的托盤中，進(jìn)行染色，以便檢查蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移是否完全。

8）可做可不做：取出硝酸纖維素濾膜置于一張干凈的濾紙上，于室溫干燥30－60分鐘，使硝酸纖維素濾膜干燥，據(jù)稱可以改善濾膜在隨后的處理中保留蛋白質(zhì)的能力；但是，這也可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)進(jìn)一步變性并因此改變其免疫反應(yīng)性，所以干燥濾膜對(duì)某些蛋白質(zhì)/抗體組合來(lái)說(shuō)可能是優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)另一些組合則可能是缺點(diǎn)，此一時(shí)而彼一時(shí)，只能針對(duì)具體靶蛋白根據(jù)實(shí)驗(yàn)來(lái)決定。

9）切去濾膜的左下角，以免鉛筆標(biāo)記被抹去。

(三)對(duì)固定于硝酸纖維素濾膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色

可供對(duì)固定于硝酸纖維素濾膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色的方法有多種，但僅有麗春紅S染色法可與所有免疫學(xué)檢測(cè)方法兼容，這是因?yàn)樵撊玖现粫?huì)短暫顯色而且在進(jìn)行Western印跡時(shí)可被洗去。因此，麗春紅S染色并不影響隨后用于檢測(cè)抗原的顯色反應(yīng)，這些顯色反應(yīng)是由已偶聯(lián)抗體的堿性磷酸酶或乳過(guò)氧化物酶等催化的。然而，由于其顯示的紫紅色不容易拍攝下來(lái)，這種染色不能提供永久性實(shí)驗(yàn)記錄，而只能提供蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移情況的直觀證據(jù)并對(duì)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物進(jìn)行定位，標(biāo)準(zhǔn)蛋白在硝酸纖維秦濾膜上的位置可用鉛筆或不褪色的墨水標(biāo)記下來(lái)。

【步驟】

1）如果硝酸纖維素濾膜已干，則把它漂浮于一盤去離子水的水面上，通過(guò)毛細(xì)作用使濾膜自下而上濕潤(rùn)。然后把濾膜浸泡于水中，浸泡5分鐘以上以驅(qū)除留于其上的氣泡。

2）把濾膜轉(zhuǎn)移到含有麗春紅S使用液的托盤中染色5-10分鐘，其間輕輕搖動(dòng)染液。

混合下列成分，配成麗春紅S貯存液(10×)：

麗春紅S 2g

三氯乙酸 30g

磺基水楊酸 30g

加水至100ml

用1份上述貯存液加9份去離子水即成麗春紅S使用液，使用后應(yīng)予廢棄。

3）蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，其間換水?dāng)?shù)次。

4）用防水性印度墨汁標(biāo)出作為分子量標(biāo)準(zhǔn)的參照蛋白的位置。

(四)封閉硝酸纖維紊濾膜的免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)

正如從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移出來(lái)的蛋白質(zhì)可以與硝酸纖維素濾膜結(jié)合一樣，免疫學(xué)檢測(cè)試劑中的蛋向質(zhì)同樣也能與之結(jié)合。Western印跡法的靈敏度取決于封閉可能結(jié)合非相關(guān)蛋白的位點(diǎn)以降低這類非特異性結(jié)合背景的效果。現(xiàn)已設(shè)計(jì)的封閉液有多種，其中脫脂奶粉最為價(jià)廉物美，既使用方便又可與通常使用的所有免疫學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)兼容。只有一種情況，也就是當(dāng)牛奶中可能含有要用Westem印跡法檢測(cè)的蛋白質(zhì)時(shí)，不能使用脫脂奶粉作為封閉劑。

【步驟】

1）把硝酸纖維素濾膜放入可以加熱封接的塑料袋中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm² 的量加入封閉液，盡可能排除里面的氣泡，然后密閉袋口，平放在平緩搖動(dòng)的搖床平臺(tái)上于室溫溫育1小時(shí)。

封閉液

0.25%(w/v)卡塞因(Caesin)

0.01%疊氮鈉（小心：疊氮鈉有毒，使用時(shí)應(yīng)戴手套謹(jǐn)慎操作，含有疊氮鈉的溶液應(yīng)標(biāo)記清楚。）

溶于pH7.4 的PBS中。

如果免疫探針的非特異結(jié)合背景仍然太高以致難以接受，可加入Tween-20至終濃度為0.02%。在大多數(shù)情況下，加入這種去污劑不至影響抗體與靶抗原的特異性結(jié)合。

2）剪開塑料袋，棄去封閉液，立即加入抗靶蛋白杭體溶液與濾膜一同溫育。

(五)抗體和靶蛋白的結(jié)合

實(shí)際上，Western印跡膜的檢測(cè)分兩步進(jìn)行：首先靶蛋白特異性的非標(biāo)記抗體在封閉液中先與硝酸纖維素濾膜一同溫育。經(jīng)洗滌后，再將濾膜與二級(jí)試劑――放射性標(biāo)記的或與辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗免疫球蛋白抗體或A蛋白一同溫育。進(jìn)一步洗滌后；通過(guò)放射自顯影或原位酶反應(yīng)來(lái)確定抗原-抗體-抗體或抗原-抗體-A蛋白復(fù)合物在硝酸纖維素濾膜上的位置。

間接法即兩步檢測(cè)法的主要優(yōu)點(diǎn)是使用單個(gè)二級(jí)試劑則可測(cè)定多種多樣的第一抗體，從而免卻了逐一純化并標(biāo)記各種第一抗體之累。因?yàn)橄驈S商購(gòu)置的二級(jí)免疫試劑，價(jià)格頗為低廉，所以可大大節(jié)約時(shí)間和金錢。

1．用抗靶蛋白的第一抗體與硝酸纖維素濾膜共溫育的方法

1）在裝有用上頁(yè)所述方法處理過(guò)的硝酸纖維素濾膜的塑料袋中，按每平方厘米0.1ml的量加人封閉液和適量的第一抗體。

應(yīng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)并按實(shí)際情況確定第一抗體的加量，推薦使用以下稀釋度：

a.多克隆抗體：1:100－1:5000。

b.雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液：不稀釋一1:100。

c.雜交瘤小鼠的腹水：1:1000―1:10,000。

2）盡可能排除藏匿的氣泡后密封袋口，將臆膜平放在乎緩搖動(dòng)的搖床平臺(tái)上，于37℃溫育1~2小時(shí)。

3）剪開塑料袋，廢棄封閉液和抗體，用25ml PBS漂洗濾膜3次，每次10分鐘。

4）按下面介紹的方法，立即用二級(jí)免疫試劑與濾膜一同溫育。

2．用二級(jí)免疫試劑與硝酸纖維素膜溫育的方法

二級(jí)試劑（通常是抗兔疫球蛋白抗體或A蛋白）可用125I進(jìn)行放射性標(biāo)記，也可與辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶共價(jià)偶聯(lián)。與酶共價(jià)偶聯(lián)的免疫球蛋白和A蛋白均有商品出售。

(1)酶聯(lián)二級(jí)試劑

1）經(jīng)PBS最后一次洗滌后，把硝酸纖維素濾膜轉(zhuǎn)移到裝有PBS溶液的托盤中，于室溫平緩搖動(dòng)溫育10分鐘。切記在加入酶聯(lián)第二試劑之前須清除濾膜上的疊氮鈉。

2）把濾膜轉(zhuǎn)移至一個(gè)可以加熱封接的塑料袋，按濾膜面積加入0.1ml/cm²無(wú)疊氮鈉的封閉液。

3）根據(jù)廠家說(shuō)明書加入酶聯(lián)二級(jí)試劑，如果使用塑料袋則應(yīng)予封口。二級(jí)試劑的稀釋度一般推薦用1:200－1:2000。

4）于37℃ 平緩搖動(dòng)、將濾膜與酶聯(lián)二級(jí)試劑一同溫育1小時(shí)。

5）把濾膜轉(zhuǎn)移至PBS溶液。于室溫平緩擺動(dòng)，溫育10分鐘。重復(fù)3次，每次更換新的PBS溶液。

6）按下文介紹的方法加入合適的生色底物。

3．酶聯(lián)抗體生色底物的使用

(1)堿性磷酸酶經(jīng)免疫反應(yīng)固定的堿性磷酸酶可催化底物5-溴-4-氯-3-吲跺磷酸/氮藍(lán)四唑（BCIP/NBT）在原位轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{(lán)色化合物。

1）配制下列3種溶液：

NBT 在10 ml 70%的二甲基甲酰胺中溶解0.5g NBT。

BCIP 在10 ml 100%的二甲基甲酰胺中溶解0.5BCIP。

堿性磷酸酶緩沖液

100 mmol/L NaCl

5 mmol/L MgCl₂

100 mmol/L Tris-Cl （pH9.5）

放在密閉容器中保存于室溫，這一溶液是穩(wěn)定的。

2）取66μl NBT溶液與10 ml堿性磷酸酶緩沖液混勻，加入33μl BCIP溶液。這一生色底物混合液應(yīng)在30分鐘內(nèi)使用。

3）把經(jīng)洗滌的硝酸纖維素濾膜[本頁(yè)頁(yè)首步驟5]轉(zhuǎn)移至一淺托盤上，按濾膜面積加入0.1ml/cm²的生色底物混合物，于室溫平緩搖動(dòng)進(jìn)行溫育。

4）細(xì)心觀察反應(yīng)過(guò)程，一俟蛋白帶的顏色深度達(dá)到要求（約20分鐘），則把濾膜移到另一托盤中，內(nèi)裝有200μl 0.5mol/L EDTA（pH8.0）和50ml PBS。

5）拍攝濾膜照片留作永久實(shí)驗(yàn)記錄。

(2)辣根過(guò)氧化物酶免疫偶聯(lián)的辣根過(guò)氧化物酶最敏感的底物是3,3'-二氨基聯(lián)苯胺，它在過(guò)氧化物酶所在部位轉(zhuǎn)變成棕色沉淀。在鈷或鎳離子存在下進(jìn)行反應(yīng)可以加深沉淀的顏色并提高反應(yīng)的靈敏度。但是，使用辣根過(guò)氧化物酶不可能完全排除背景顏色，因此須十分小心地觀察生色反應(yīng)，一俟特異性染色蛋白帶清晰可見，就應(yīng)盡快終止生色反應(yīng)。

1）在9ml的0.0l mol/L Tris-Cl（pH7.6）溶液中溶解6mg的二氨基聯(lián)苯胺（臨用前配制）。

2）用濾紙過(guò)濾底物溶液以去除可能形成的沉淀物。

3）加入10μl 30%H₂O₂ ，混勻后立即使用。得到的30%H₂O₂ 溶液，應(yīng)保存于密閉的棕色瓶中，數(shù)周后應(yīng)予廢棄。

4）把經(jīng)漂洗的硝酸纖維素濾膜移至一淺托盤上，按濾膜面積加入0.1 ml/cm²的底物溶液，于室溫輕輕搖動(dòng)溫育之。

5）細(xì)心觀察反應(yīng)過(guò)程，一俟蛋白帶的顏色深度達(dá)到要求（約1-3分鐘），即用水略為漂洗，然后把濾膜轉(zhuǎn)移到PBS 中。

6）拍攝濾膜照片，留作永久實(shí)驗(yàn)記錄。過(guò)氧他物酶染色的蛋白帶經(jīng)日光照射數(shù)小時(shí)后將褪去顏色。

蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司成立于2008年，位于蘇州園區(qū)生物納米園（Biobay）A5幢301室。公司管理團(tuán)隊(duì)專注于科學(xué)儀器行業(yè)十四年，擁有專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)與完善的售后服務(wù)體系，目前已為300余家實(shí)驗(yàn)室提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)，涵蓋各大高校、檢測(cè)中心、科研機(jī)構(gòu)、制藥企業(yè)等13個(gè)群體。提供的實(shí)驗(yàn)室儀器主要包括振蕩培養(yǎng)箱，恒溫恒濕培養(yǎng)箱、二氧化碳培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、PCR儀，瑞寧移液器，生物反應(yīng)器，發(fā)酵罐，超低溫冰箱，液氮罐，高壓滅菌器，超純水機(jī)，天平，離心機(jī)，離心濃縮儀、研磨機(jī)、葡萄糖乳酸分析儀等。廠商企業(yè)授權(quán)包括知楚儀器、朗基、中科美菱，梅特勒，樂(lè)楓，搏旅、NEST、天根、奧盛在內(nèi)的80個(gè)余廠家。