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抗體表達細胞株構建服務

CHO 細胞系基因組本身具有不穩(wěn)定性。通常，中國倉鼠體細胞的染色體為 11 對22 條，而中國倉鼠卵巢細胞的染色體則發(fā)生了大面積不穩(wěn)定重排重組現(xiàn)象，不同細胞系染色體的數(shù)目也不恒定。基因組的不穩(wěn)定性，主要表現(xiàn)在其染色體層面上的拷貝數(shù)變異。

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抗體表達細胞株構建服務

基于CHO 細胞的抗體表達

抗體廣泛存在于生物醫(yī)學研究、創(chuàng)新藥發(fā)展中，且需求量大。然而，滿足國際市場日益增長的抗體需求量是一個巨大的挑戰(zhàn)。為了維持抗體的供求平衡，科學家們發(fā)明了更好的方法來優(yōu)化抗體的表達，以達到增加抗體的單體積表達量并減少生產(chǎn)成本。由于新的克隆方法、基因改造技術以及一系列的細胞和載體工程技術，加上發(fā)酵技術上的改進，這些都使抗體表達得益較大。

哺乳動物細胞是抗體藥物產(chǎn)品使用的主要表達系統(tǒng)，主要包括Sp2/0骨髓瘤細胞、 NS0小鼠骨髓瘤細胞、 HEK293人胚胎腎細胞和CHO中國倉鼠細胞，其中以CHO系應用較廣泛。

| 基于CHO細胞的抗體表達系統(tǒng)簡介

CHO細胞譜系

細胞株開發(fā)常用的CHO細胞：DG44, DUXB11, CHO-S, CHO-K1 WT, CHO-K1 GS-/-

	篩選標記	篩選試劑
代謝型篩選標記 (擴增型基因篩選標記)	二氫葉酸還原酶（DHFR）	甲氨蝶呤 (MTX)
代謝型篩選標記 (擴增型基因篩選標記)	谷氨酰胺合成酶（GS）	氨基亞砜蛋氨酸 (MSX)
抗生素篩選標記 (非擴增型基因篩選標記)	嘌呤霉素搞性（Puromycin acetyltransferase）	嘌呤霉素 (Puromycin)
	殺稻瘟脫氫酶（Blasticidin deaminase）	殺稻瘟霉素 (Blasticidin)
	組氨醇脫氫酶（Histidinol dehydrogenase）	組氨醇 (Histidinol)
	潮霉素磷酸轉移酶(Hygromycin phosphotransferase)	潮霉素 (Hygromycin)
	氯林可霉素而藥基因（Zeocin resistance gene）	氯林可霉素 (Zeocin)
	博來霉素耐藥基因（Bleomycin resistance gene）	博來霉素 (Bleomycin)
	氨基糖苷磷酸轉移酶（Aminoglycoside phosphotransferase）	新霉素 (Neomycin or G418)

CHO細胞的優(yōu)點

1. CHO細胞遺傳背景清晰，不易傳播人類病毒，具有很高的安全性，以CHO作為宿主細胞表達生物蛋白質(zhì)，容易被藥物審核機構，如FDA審批通過
2. CHO細胞可以通過懸浮馴化適應無血清懸浮培養(yǎng)，并能夠實現(xiàn)在無血清培養(yǎng)基中快速及高密度生長，這為藥物的質(zhì)量控制和大規(guī)模生產(chǎn)帶來極大的便利和實惠；
3. CHO細胞表達的重組蛋白質(zhì)能夠獲得類似于人源蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，如翻譯后的糖基化修飾、唾液酸化修飾等，生產(chǎn)的蛋白質(zhì)較其它表達系統(tǒng)更加與人體天然的生物蛋白質(zhì)相似第四，較少分泌內(nèi)源性蛋白，降低純化難度；
4. CHO細胞已經(jīng)開發(fā)出了多種商業(yè)化高效高表達系統(tǒng)，如二氫葉酸還原酶篩選體系、谷氨酰胺合成酶篩選體系和遺傳霉素篩選體系等。

CHO細胞的異質(zhì)性特征

CHO細胞在長期傳代過程中存在的穩(wěn)定性表達問題，主要體現(xiàn)在：
1. CHO 細胞遺傳不穩(wěn)定性引起的表達不穩(wěn)定
CHO 細胞系基因組本身具有不穩(wěn)定性。通常，中國倉鼠體細胞的染色體為 11 對22 條，而中國倉鼠卵巢細胞的染色體則發(fā)生了大面積不穩(wěn)定重排重組現(xiàn)象，不同細胞系染色體的數(shù)目也不恒定?；蚪M的不穩(wěn)定性，主要表現(xiàn)在其染色體層面上的拷貝數(shù)變異。

2. 外源基因隨機整合引起的表達不穩(wěn)定
傳統(tǒng)方法主要是通過表達質(zhì)粒轉染后，利用壓力篩選從而獲得目的蛋白質(zhì)表達細胞株。因此，外源基因都是通過隨機整合方式，整合到CHO 基因組內(nèi)。由于整合位點的不確定性，可能在細胞培養(yǎng)后期引起表達不穩(wěn)定。

CHO細胞染色體

中國倉鼠卵巢細胞擁有22 條染色體，其中10 對常染色體及2 條性染色體。而CHO-K1 細胞系則顯示出與其有極大的不同，其僅有8 條染色體顯示出同普通中國倉鼠染色體相同，而13個染色體則以“Z” 標志，因其中包含著染色體重排、缺失、移位等現(xiàn)象。

| 抗體表達CHO細胞株的構建策略與流程

1. 細胞內(nèi)的蛋白表達過程

轉錄 → mRNA加工 → 翻譯 → 翻譯后折疊與修飾 → 細胞內(nèi)轉運 → 分泌

蛋白表達

2. 抗體表達CHO細胞株的構建策略

CHO細胞株構建

Representation of different steps involved in building an efficient system for protein expression

3. 重組蛋白表達工程細胞株的構建流程圖

載體構建 → 轉染 → 細胞池(pool) 篩選 → 單克隆化篩選 → 批次補料培養(yǎng)篩選 → 蛋白質(zhì)量篩選 → 細胞株最終選定與建庫 → 細胞培養(yǎng)工藝開發(fā)與生產(chǎn)

細胞增殖效果

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