堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶和β-半乳糖苷酶是ELISA中很少使用的酶。

ELISA 在原理上類似于放射免疫測(cè)定 (RIA)，但更安全且成本較低。

ELISA 有助于抗原或抗體的定性（存在或不存在）和定量（濃度）測(cè)量。

當(dāng)前使用的酶聯(lián)免疫分析技術(shù)主要有以下幾種：

1.直接ELISA

直接和間接 ELISA 都從將抗原包被到 ELISA 板上開(kāi)始。

步驟：

•   將抗原添加到板中，在 37 攝氏度下孵育一小時(shí)或在 4 攝氏度下孵育過(guò)夜。
•   孵育步驟完成后，下一步是清洗任何潛在未結(jié)合抗體的板，并使用 BSA、卵清蛋白、抑肽酶或其他動(dòng)物蛋白等試劑封閉 ELISA 板上任何未結(jié)合的位點(diǎn)。
•   這一步很重要，因?yàn)樗梢苑乐谷魏畏翘禺愋钥贵w與板結(jié)合，并盡可能地減少假陽(yáng)性結(jié)果。添加緩沖液后，重新洗滌板，并添加選定的 酶聯(lián)檢測(cè)一抗 。將板進(jìn)一步溫育一小時(shí)。
•   在直接 ELISA 中，主要檢測(cè)抗體直接與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合。
•   接下來(lái)，重新洗滌板以去除任何未結(jié)合的抗體，然后向板中添加底物/發(fā)色團(tuán)，例如堿性磷酸酶 (AP) 或辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)，從而導(dǎo)致顏色變化。樣品的顏色變化是通過(guò) AP 從底物中水解磷酸基團(tuán)或通過(guò) HRP 氧化底物而發(fā)生的。

  使用直接 ELISA 的優(yōu)勢(shì)主要是消除二抗交叉反應(yīng)，并且由于步驟更少，與間接 ELISA 相比速度更快。它的缺點(diǎn)包括與其他類型的 ELISA 相比靈敏度低，反應(yīng)成本高。

2. 間接 ELISA

    間接 ELISA 的步驟與直接 ELISA 相同，除了額外的洗滌步驟和去除緩沖液后添加的抗體類型。間接 ELISA 需要兩種抗體，一種是粘附在目的蛋白上的檢測(cè)一抗，另一種是與一抗互補(bǔ)的酶聯(lián)二抗。

    開(kāi)始需要加入一抗，然后進(jìn)行洗滌步驟，再加入酶聯(lián)二抗并孵育。此后，步驟與直接 ELISA 相同，包括洗滌步驟、添加底物和檢測(cè)顏色變化。

簡(jiǎn)要步驟如下：

• 將含有一抗 (Ab1) 的樣品添加到抗原包被的微量滴定孔中，然后附著在孔中的抗原與 Ab1 發(fā)生反應(yīng)。
• 未結(jié)合或游離的 Ab1 都被洗掉，酶標(biāo)二級(jí)抗體 (Ab2) 被添加到微量滴定孔中。
• 與酶偶聯(lián)的二抗與一抗結(jié)合。
• 游離或未結(jié)合的 Ab2 都被洗掉，并添加酶的特定底物。
• 形成的有色反應(yīng)產(chǎn)物的量的測(cè)定主要由紫外分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、微孔板讀板機(jī)等儀器來(lái)完成。

       間接 ELISA法也常用于檢測(cè)血清中是否存在抗 HIV 抗體。與直接 ELISA 相比，間接 ELISA 具有較高的靈敏度，反應(yīng)成本較低，這種類型的 ELISA 的主要缺點(diǎn)是二級(jí)檢測(cè)抗體之間存在交叉反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。 

3.  酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-夾心式elisa

與直接和間接 ELISA 不同，夾心 ELISA 從包被到板孔上的捕獲抗體開(kāi)始。因?yàn)榭乖瓓A在兩層抗體（捕獲抗體和檢測(cè)抗體）之間，所以也稱為“三明治”。

   流程如下：將捕獲抗體添加到板中后，將板蓋上并在 4°C 下孵育過(guò)夜。包被步驟完成后，用 PBS 清洗板，然后用 BSA緩沖/封閉。緩沖液洗滌在室溫下進(jìn)行至少 1-2 小時(shí)。末了，在加入抗原之前用PBS再次洗滌板。

   然后將目標(biāo)抗原添加到板中以與捕獲抗體結(jié)合并在 37 攝氏度下孵育 90 分鐘。重新清洗板，然后將檢測(cè)一抗添加到板中并再孵育 1 至 2 小時(shí)在室溫下，然后用緩沖液清洗。然后加入酶聯(lián)二抗，再孵育 1 至 2 小時(shí)。重新清洗板，加入底物以產(chǎn)生顏色變化。夾心 ELISA 在所有 ELISA 類型中具有具有較高的靈敏度。夾心式elisa 的主要缺點(diǎn)是會(huì)耗費(fèi)較多的時(shí)間和費(fèi)用，另外這種ELISA 方法，必須要使用配對(duì)的抗原（二價(jià)/多價(jià)抗原）和二抗。

簡(jiǎn)略步驟如下：

• 使用夾心式elisa，抗體被固定在微量滴定孔中，而不是抗原。
• 添加含有待檢測(cè)或測(cè)量的抗原的樣品并使其與固定化抗體反應(yīng)。
• 清洗孔并加入對(duì)抗原上不同表位具有特異性的第二種酶聯(lián)抗體，并使其與結(jié)合的抗原反應(yīng)。
• 通過(guò)洗滌去除任何游離的二抗后，加入酶特異性底物。
• 這稱為夾心 ELISA，因?yàn)榇龣z測(cè)的抗原夾在兩種抗體（結(jié)合抗體和酶聯(lián)抗體）之間。
• 末了，通過(guò)分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀等實(shí)驗(yàn)室儀器使用分光光度法來(lái)測(cè)定有色反應(yīng)產(chǎn)物。

4. 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA

  競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA方法主要用于檢測(cè)血清中是否具有特異性的抗原/抗體。這種類型的 ELISA 會(huì)使用兩種特異性抗體，一種酶聯(lián)抗體和另一種存在于測(cè)試血清中的抗體（如果血清呈陽(yáng)性）。將兩種抗體結(jié)合到孔中將允許競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗原。顏色變化的存在意味著測(cè)試是陰性的，因?yàn)槊附Y(jié)合抗體結(jié)合了抗原（而不是測(cè)試血清的抗體）。沒(méi)有顏色表明測(cè)試呈陽(yáng)性，并且測(cè)試血清中存在抗體。

     該技術(shù)中，需要將抗體與溶液形式的抗原（在樣品中）一起孵育，然后將該混合物添加到抗原包被的微量滴定孔中。樣品中存在的抗原越多，可用于結(jié)合抗原包被孔的游離抗體就越少。添加對(duì)一抗同種型具有特異性的酶偶聯(lián)二抗 (Ab2) ，用于確定與孔結(jié)合的一抗數(shù)量，如在間接 ELISA 中一樣。

    競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA 特異性低，不能用于稀釋樣品。然而，好處是需要的樣品純化較少，它可以測(cè)量給定樣品中的大范圍抗原，可用于小抗原。然而，需要注意的是在該技術(shù)中，原始樣品中抗原的濃度越高，吸光度越低。 

 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ELISA的應(yīng)用：

1.檢測(cè)和測(cè)量給定樣品中的抗原或抗體。（自身抗體：抗 dsDNA、抗 dsg1、ANA 等；傳染病抗體：抗菌、抗病毒、抗真菌；甲型、乙型、丙型肝炎、艾滋病毒等）

2.檢測(cè)和估計(jì)腫瘤標(biāo)志物的水平：比如：前列腺特異性抗原 (PSA)、癌胚抗原 (CEA)

• 檢測(cè)食品樣品中的潛在過(guò)敏原。
• 用于某些類別藥物的快速推定篩選。
• 肽、抗體、激素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的檢測(cè)和定量
• 外泌體檢測(cè)、細(xì)胞外囊泡檢測(cè)等

 影響酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA結(jié)果的因素有哪些？

主要包括檢測(cè)板、包被緩沖液、捕獲抗體、封閉緩沖液、靶抗原、檢測(cè)抗體、酶偶聯(lián)物、洗滌液、底物、信號(hào)檢測(cè)的質(zhì)量和完整性都會(huì)干擾正確的 ELISA 測(cè)試。一些可能干擾測(cè)試的因素如下：

1.微孔板：孔的形狀和質(zhì)量、板的材料、潛在的預(yù)激活、均勻或不均勻的涂層

2.緩沖液：pH、污染

3.捕獲和檢測(cè)抗體：孵育時(shí)間、溫度、特異性、滴度、親和力

4.封閉緩沖液：交叉反應(yīng)、濃度、污染

5.靶抗原：構(gòu)象、穩(wěn)定性、表位

6.酶結(jié)合物：類型、濃度、功能、交叉反應(yīng)

7.清洗：污染、頻率、體積、持續(xù)時(shí)間、成分

8.基板：微孔板的質(zhì)量、材質(zhì)

9.檢測(cè)：檢測(cè)相關(guān)的儀器設(shè)備：比如：分光光度計(jì)、讀板機(jī)等相關(guān)因素

10. 誤差：人為誤差（實(shí)驗(yàn)步驟不規(guī)范等）

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