小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染細(xì)胞是常用的基因沉默技術(shù)，以下為相關(guān)操作技巧：

一、轉(zhuǎn)染前細(xì)胞準(zhǔn)備

- 細(xì)胞狀態(tài)：

- 細(xì)胞需處于良好生長(zhǎng)狀態(tài)，活力要在90%以上。比如貼壁細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前剛完成一次傳代，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)胞代謝旺盛，攝取外界物質(zhì)能力強(qiáng)，利于siRNA轉(zhuǎn)染。

- 要避免細(xì)胞過(guò)度密集或稀疏。細(xì)胞過(guò)于密集會(huì)使?fàn)I養(yǎng)和空間不足，影響轉(zhuǎn)染效率；過(guò)于稀疏則難以檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。貼壁細(xì)胞匯合度在70 - 80%左右轉(zhuǎn)染較合適。

- 培養(yǎng)基更換：

- 轉(zhuǎn)染前需更換新鮮培養(yǎng)基，因舊培養(yǎng)基成分可能干擾轉(zhuǎn)染試劑和siRNA活性。含高濃度血清的培養(yǎng)基可能與轉(zhuǎn)染試劑結(jié)合，降低轉(zhuǎn)染試劑 - siRNA復(fù)合物形成效率，一般建議用無(wú)血清或低血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染。

二、siRNA準(zhǔn)備

- 質(zhì)量檢測(cè)：

- 確認(rèn)siRNA的純度和完整性，可用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否降解，高質(zhì)量siRNA電泳時(shí)應(yīng)呈現(xiàn)清晰條帶，無(wú)拖尾現(xiàn)象。

- 測(cè)定siRNA濃度，其精確濃度對(duì)確定轉(zhuǎn)染試劑用量和轉(zhuǎn)染復(fù)合物比例很關(guān)鍵，通常用紫外分光光度計(jì)測(cè)其在260nm波長(zhǎng)處吸光度來(lái)計(jì)算濃度。

- 設(shè)計(jì)優(yōu)化：

- 合理設(shè)計(jì)siRNA序列，要特異性針對(duì)目標(biāo)基因，避免與其他非靶基因有較高同源性以減少脫靶效應(yīng)，可借助生物信息學(xué)軟件輔助設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)后最好通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證有效性。

- 對(duì)于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或基因，可嘗試不同siRNA序列轉(zhuǎn)染，或采用化學(xué)修飾的siRNA提高轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性。

三、轉(zhuǎn)染試劑選擇與使用

- 選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑：

- 依細(xì)胞類(lèi)型選轉(zhuǎn)染試劑，不同細(xì)胞對(duì)其敏感性不同。例如脂質(zhì)體類(lèi)適用于多種細(xì)胞類(lèi)型，但對(duì)某些原代細(xì)胞或難轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可能需用陽(yáng)離子聚合物類(lèi)轉(zhuǎn)染試劑或病毒載體實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染。

- 考慮轉(zhuǎn)染試劑毒性，部分轉(zhuǎn)染試劑可能致細(xì)胞死亡或生長(zhǎng)異常，選擇時(shí)需查閱文獻(xiàn)或做預(yù)實(shí)驗(yàn)評(píng)估毒性。

- 優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑 - siRNA復(fù)合物的形成：

- 嚴(yán)格按轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)制備復(fù)合物，一般在無(wú)血清緩沖液中混合轉(zhuǎn)染試劑和siRNA，注意混合順序，通常先加轉(zhuǎn)染試劑入緩沖液輕輕混勻，再加siRNA，然后孵育一段時(shí)間讓復(fù)合物充分形成。

- 優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑和siRNA的比例，不同組合可能需不同比例達(dá)好的轉(zhuǎn)染效果，可設(shè)比例梯度實(shí)驗(yàn)確定合適用量。

四、轉(zhuǎn)染過(guò)程操作

1. -加樣方式：

2. - 將轉(zhuǎn)染試劑 - siRNA復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)孔或培養(yǎng)瓶時(shí)，要緩慢滴加，邊滴加邊輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)容器，使復(fù)合物均勻分布，避免局部濃度過(guò)高致細(xì)胞損傷或轉(zhuǎn)染不均勻。

3. - 對(duì)于貼壁細(xì)胞，盡量將復(fù)合物直接滴加到培養(yǎng)基中，不接觸細(xì)胞表面，減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷。

4. - 轉(zhuǎn)染時(shí)間和溫度：

5. - 控制轉(zhuǎn)染時(shí)間，不同轉(zhuǎn)染試劑和細(xì)胞類(lèi)型所需轉(zhuǎn)染時(shí)間不同，一般轉(zhuǎn)染復(fù)合物和細(xì)胞孵育時(shí)間在4 - 24小時(shí)之間，過(guò)長(zhǎng)孵育時(shí)間可能增加轉(zhuǎn)染試劑毒性，過(guò)短則轉(zhuǎn)染效率低下。

6. - 注意轉(zhuǎn)染溫度，多數(shù)轉(zhuǎn)染在37°C進(jìn)行，但對(duì)溫度敏感的轉(zhuǎn)染試劑或細(xì)胞，可能需在較低溫度下轉(zhuǎn)染以提高效率和細(xì)胞存活率。

五、轉(zhuǎn)染后處理

1.培養(yǎng)基更換：

- 轉(zhuǎn)染后適時(shí)更換培養(yǎng)基，若轉(zhuǎn)染試劑毒性大，轉(zhuǎn)染后4 - 6小時(shí)就應(yīng)換為含血清的完全培養(yǎng)基，減少其對(duì)細(xì)胞持續(xù)傷害，但若換得過(guò)早，可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)染復(fù)合物還未充分發(fā)揮作用就被移除，要依實(shí)際情況調(diào)整。

2. 檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)選擇：

- 合理選擇檢測(cè)基因沉默效果的時(shí)間點(diǎn)，一般轉(zhuǎn)染后24 - 72小時(shí)內(nèi)可檢測(cè)到目標(biāo)基因表達(dá)下降，但不同基因和細(xì)胞類(lèi)型會(huì)有差異，可用實(shí)時(shí)定量PCR或Western blotting等方法檢測(cè)基因沉默效果。
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