怎么用Nanodrop 測定雙鏈RNA濃度？

使用Nanodrop光度計測定雙鏈RNA（dsRNA）的濃度是一個簡單的過程，但需要正確的方法和適當(dāng)?shù)膶φ铡?

以下是一般步驟：

1.準(zhǔn)備工作：

確保樣品清潔：確保您的dsRNA樣品沒有蛋白質(zhì)或其他污染物，因為這些可能會干擾測量。

使用無RNAase的管和工具：在整個過程中使用無RNAase的管和工具，以避免RNA的降解。

2.Nanodrop操作步驟：

• l 開機并校準(zhǔn)Nanodrop：
• l 打開Nanodrop光度計，并確保其已經(jīng)校準(zhǔn)并且溫度穩(wěn)定。
• l 設(shè)置測量程序：
• l 在Nanodrop軟件中選擇“RNA”模式，因為dsRNA的測量與單鏈RNA類似。
• l 準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品（可選，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線）：
• l 如果您有已知濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品，可以準(zhǔn)備一系列稀釋液，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，以更準(zhǔn)確地確定未知樣品的濃度。
• l 測量dsRNA樣品：
• l 將dsRNA樣品稀釋（如果必要的話），通常使用無RNAase的水或TE緩沖液。
• l 使用無RNAase的槍頭，將稀釋后的樣品直接滴入Nanodrop的測量槽中。
• l 關(guān)閉測量槽蓋子，確保沒有氣泡。
• l 在軟件中，選擇“Measure”來開始測量。
• l 讀取結(jié)果：
• l Nanodrop軟件會顯示吸光度（A）值，特別是260納米（A260）的吸光度。
• l 記錄A260的吸光度值，并檢查A260/A280和A260/A230的比值，以評估樣品的純度。

對于dsRNA，理想的A260/A280比值通常在1.8到2.0之間。A260/A230比值應(yīng)該大于1.5。

3.計算濃度：

如果您沒有使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以使用以下公式計算dsRNA的濃度：

 這里的40是一個常數(shù)，代表每微克/毫升單鏈RNA在260納米的吸光度。對于雙鏈RNA，這個常數(shù)可能略有不同，通常在33-37之間，具體取決于dsRNA的堿基組成和結(jié)構(gòu)。建議使用制造商提供的具體數(shù)值或通過標(biāo)準(zhǔn)品確定該值。

4.重復(fù)測量：

為了確保準(zhǔn)確性，可以對每個樣品重復(fù)測量幾次，并計算平均值。

5.注意事項：

• l 確保在測量前將dsRNA樣品充分混勻。
• l 避免氣泡和樣品污染，這些都可能影響測量結(jié)果。
• l 如果樣品的A260/A280或A260/A230比值不理想，可能需要進一步純化樣品。
• l 使用Nanodrop光度計時，請務(wù)必參考設(shè)備的操作手冊和制造商的建議，以確保獲得最準(zhǔn)確和可靠的結(jié)果。

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